CRISPR筛选技术解锁肿瘤免疫治疗新靶点
自然杀伤细胞（NK细胞）作为免疫系统的重要组成部分具有广阔的开发潜力，但其较弱的扩增能力导致转染效率低下和基因编辑困难等问题。通过肿瘤-免疫相互作用的研究范式，研究者首先对肿瘤细胞进行编辑以筛选与NK细胞相关的配体，继而基于筛选结果对NK细胞实施精准化编辑，这种递进式策略成功揭示了肿瘤细胞表面NK细胞检查点IGSF8与人源NK细胞KIR3DL2受体间的特异性互作机制。值得关注的是，Sidi Chen团队创新性地利用AAV-SB-CRISPR系统，首次对原代小鼠NK细胞实施体内CRISPR敲除筛选，随后将编辑后的NK细胞移植至四种不同实体瘤模型小鼠体内，系统鉴定了促进NK细胞肿瘤浸润的遗传检查点。筛选结果不仅发现Plxna1、Sort1和CALHM2等多个基因的敲除与NK细胞肿瘤浸润增强相关，更通过单细胞转录组测序等技术证实CALHM2敲除的CAR-NK细胞展现出更强的抗肿瘤活性。
作为免疫系统的重要成员，B细胞通过分化为浆细胞或记忆B细胞构筑机体抗病原体防线。在B细胞发育、活化及生发中心应答过程中，CD40分子发挥着关键作用。研究团队采用表达Cas9蛋白的Daudi B细胞进行CD40功能缺失分析，通过全基因组CRISPR筛选结合三聚体Mega-CD40L刺激转染实验，经流式细胞术验证发现FBXO11基因敲除导致CD40诱导水平降低。这揭示了泛素连接酶FBXO11通过靶向抑制因子CTBP1和BCL6来维持CD40表达，进而调控B细胞归巢与驻留的新机制。近期针对B细胞内RNA解旋酶功能的研究中，科研人员通过CRISPR/Cas9技术对逆转录病毒感染的生发中心B细胞（iGCB）进行Dhx33等基因的sgRNA靶向编辑，该模型由Cas9-GFP细胞、野生型B细胞与IL-4共培养的40LB细胞共同诱导形成。研究最终证实了活化诱导型RNA解旋酶在B细胞中的核心地位，特别是Dhx33基因在耦联B细胞活化、生长与增殖中的关键作用，其通过促进活化态B细胞的rDNA转录来驱动蛋白质合成与细胞增殖进程。
T细胞的高通量筛选研究进展
T细胞作为免疫系统的重要组成部分，在肿瘤发生发展过程中具有关键作用。基于T细胞的免疫疗法（如检查点抑制剂和序贯性细胞疗法）正逐步改变肿瘤治疗格局，但以工程化T细胞为主的过继性细胞治疗（ACT）仍面临显著局限性。研究表明，回输的工程化T细胞在患者体内通常呈现短暂存活状态，且难以有效突破肿瘤组织的免疫抵抗屏障。正常情况下，机体在针对病原体或肿瘤细胞产生免疫应答后，会形成具有自我更新能力的长效记忆T细胞（Tmem），当再次遭遇相同感染或肿瘤时，这些细胞能快速增殖产生大量细胞毒性CD8+ T细胞。然而在复杂的肿瘤微环境中，CD8+ T细胞需要充足的营养和能量维持其抗肿瘤活性，这依赖于强大的代谢功能。当无法彻底清除感染或肿瘤时，细胞毒性T细胞会逐渐丧失功能（即耗竭状态）。
为突破这一瓶颈，研究者运用CRISPR/Cas9文库筛选技术系统性敲除3000余个T细胞代谢相关基因，通过小鼠抗肿瘤ACT模型验证基因功能，最终发现200多个基因能显著影响肿瘤荷瘤小鼠体内回输CD8+ T细胞的存活时间与功能。其中编码REGNASE-1酶的基因功能最为突出：缺乏REGNASE-1的CD8+ T细胞线粒体功能显著增强，其氧耗增加带来能量代谢提升；这类细胞在肿瘤组织内的积累量是常规CD8+ T细胞的2000倍，且在对抗黑色素瘤和急性淋巴细胞白血病方面展现出优于野生型CD8+ T细胞的性能。研究团队进一步利用CRISPR/Cas9敲除文库对REGNASE-1缺陷型CD8+ T细胞中约20000个基因进行破坏，发现BATF与PTPN2/SOCS1两个关键蛋白在T细胞分化过程中协同作用，为优化肿瘤免疫治疗提供了新靶点。
关于T细胞耗竭这一影响ACT疗效的核心因素，其调控机制研究持续成为热点。Charles A. Gersbach团队通过表观遗传CRISPR筛选系统解析了120个转录及表观调控因子对人CD8+ T细胞状态的影响。在平行开展的CRISPR敲除筛选中，BATF3过表达可降低T细胞耗竭相关基因程序及免疫抑制性调节T细胞功能相关基因表达，同时促进记忆T细胞发育。值得注意的是，BATF3参与的转录过程与ACT临床应答强度相关，并能提升CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力，成为极具潜力的治疗靶点。Chen团队则采用全基因组激活筛选平台dgRNA-CRISPR对OT-1小鼠来源的原代CD8+ T细胞进行编辑，通过与E0771肿瘤细胞共培养开展细胞毒性实验，发现PRODH2过表达可显著增强CD8+ T细胞抗肿瘤活性。在无IL-2条件下，PRODH2-OE CD8+ T细胞仍保持较高增殖率。值得注意的是，三组小鼠模型验证显示，通过腺病毒或慢病毒载体构建的BCMA-CAR-PRODH2重组细胞均展现出更强的抗肿瘤效应，证实该靶点对CAR-T治疗的增效潜力。