CRISPR筛选技术解锁肿瘤免疫治疗新靶点
尽管肿瘤免疫治疗取得显著进展，但肿瘤异质性对免疫应答的影响仍为精准诊疗带来持续性挑战。动态演变的肿瘤微环境不仅改变免疫应答强度，还会影响肿瘤浸润免疫细胞（尤其是T细胞）的功能状态。通过CRISPR/Cas9系统对免疫效应（包括抗原呈递、免疫细胞激活/耗竭、细胞毒性、免疫检查点响应等）进行多维度筛选，研究者得以深入解析抗肿瘤免疫的具体调控机制。例如在免疫治疗耐药研究中，BCL-2和B3GNT2被证实是肿瘤细胞抵抗细胞毒性T细胞的关键驱动因子，抑制这两个蛋白可显著增强肿瘤组织对免疫治疗的敏感性。由此可见，借助现代筛选技术发掘更精准的诊断标志物和治疗靶点仍是当前研究重点。
肿瘤功能基因筛选策略
功能基因的筛选与表征是肿瘤治疗研究的重要基石，其发展高度依赖于前沿技术体系的创新。正向筛选策略以特定表型为切入点，通过分子生物学技术筛选候选基因，进而评估其功能并验证基因与表型的关联机制。以神经胶质瘤研究为例，Zhou团队运用单细胞RNA测序技术揭示氧化应激小胶质细胞通过影响CD8+ T细胞抗原呈递能力促进肿瘤进展，最终验证核心转录因子NR4A2的免疫治疗增效作用。除高通量测序外，全基因组关联研究（GWAS）、差异表达谱分析及生物信息学分析均为肿瘤研究中常用的正向遗传学筛选手段。相比之下，反向筛选策略基于已知DNA序列信息，通过定向修饰不同研究对象基因以改变其生物学特性，继而筛选目标表型并回溯验证功能基因。目前反向筛选已在肿瘤学领域广泛应用，主要技术体系包括互补DNA（cDNA）文库、RNA干扰（RNAi）文库、CRISPR/Cas9筛选以及基于转座子的诱变筛选等。
CRISPR/Cas9介导的功能性基因筛选策略研究体系
作为目前研究最深入、应用最成熟的高效基因编辑工具，CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和由tracrRNA与crRNA复合形成的单链向导RNA（sgRNA）构成。该系统的递送形式通常包含质粒DNA（pDNA）、RNA或Cas9核糖核蛋白复合体（RNP，ribonucleoprotein）三种形式，其中基于pDNA的CRISPR/Cas9系统是目前最常用的形式。该技术应用的核心挑战在于如何实现靶向细胞的精准递送，这一过程需借助载体的协助。目前常用的运输方式主要分为两类：病毒载体和非病毒载体。随着载体技术的成熟，非病毒载体已发展出多样化形式，包括脂质纳米载体、高分子聚合物纳米颗粒、外泌体、金纳米颗粒递送系统以及仿生纳米材料等。
在肿瘤研究领域，基于CRISPR系统的高通量遗传筛选已成为快速发现癌驱动基因或肿瘤免疫调节因子的重要手段。其通过设计大量sgRNA靶向不同细胞中的数百个基因，经实验筛选编辑后的细胞群，最终鉴定出与特定表型相关的关键基因。由Broad研究所张锋团队开发的CRISPR-Cas9文库（亦称全基因组CRISPR筛选或高通量基因编辑技术），通过构建全基因组sgRNA文库，在不同细胞中同步编辑不同基因，结合特异性筛选方法，并借助高通量测序与生物信息学分析完成候选基因的筛选。Cas9蛋白可诱导基因组双链断裂（DSB，double-strand breaks），经非同源末端连接（NHEJ，non-homologous end joining）修复时产生的移码突变会导致基因编码肽链序列改变，从而实现靶基因的敲除（Knock-out, KO）。在肿瘤免疫学研究中，组合式抗肿瘤药物耐药实验（CADRE，combinatorial Antineoplastic Drug Resistance Experiment）以B16F10-OVA-Cas9细胞为模型，通过靶向1159个基因对的非对称sgRNA文库，重点解析突变型抑癌基因与免疫抵抗基因的相互作用。经sgRNA慢病毒文库转导的肿瘤细胞与OT-I CD8+ T细胞共培养后，收集存活细胞进行基因组提取及NGS分析，揭示了抑癌基因与免疫抵抗基因的互作网络，为靶向新型肿瘤突变提供了理论依据。值得注意的是，当存在修复模板时，DNA双链断裂可触发同源定向修复（HDR，homology-directed repair）。然而由于HDR效率较低，研究人员常需采取优化策略：通过细胞周期同步化使其处于活跃分裂期，或使用化学抑制剂抑制NHEJ通路关键基因，从而有效提升HDR效率。随着CRISPR技术的持续创新，新型平台CLASH展现出高效、高通量及低毒性优势，其支持构建规模更大、适用性更广的文库，为实现精准大规模编辑提供了可能。该平台不仅加速了候选细胞疗法的发现进程，更为人类细胞治疗方案的评估建立了可靠平台。