CRISPR筛选技术解锁肿瘤免疫治疗新靶点
值得注意的是，肿瘤免疫治疗效果与T细胞的肿瘤杀伤能力、存活时间及增殖能力（数量）密切相关。作为新型肿瘤治疗的核心，CD8+ T细胞的功能调控基因发现对于开辟不同免疫治疗路径至关重要，毕竟仍有大量患者对现有获批疗法缺乏响应。在肿瘤免疫治疗领域，过继性细胞治疗（ACT）技术通过基因修饰增强T细胞对特定肿瘤抗原的识别与杀伤能力，已在血液系统恶性肿瘤中显示出良好疗效。CRISPR技术与高通量测序技术的结合，为特定表型相关基因的高通量精准筛选提供了可能。同时，系统性筛选体内T细胞调控因子可为免疫治疗提供潜在药物靶点。例如在急性髓系白血病（AML）研究中，科研人员通过对肿瘤细胞系MV4-11、U937及患者来源异种移植（PDX）模型进行CRISPR筛选，揭示了与AML细胞代谢和抗凋亡相关的关键基因SLC5A3和MARCH5。这类方法通常涉及将体外编辑后的肿瘤细胞重新植入小鼠体内，进而发现与肿瘤自身相关的关键基因。目前通过体内筛选已报道的基因类型包括癌基因、抑癌基因以及合成致死基因等。值得注意的是，将经过编辑的免疫细胞植入荷瘤小鼠体内，能更有效地筛选出与肿瘤免疫高度相关的关键基因。在三阴性乳腺癌（TNBC，triple-negative breast cancer）模型小鼠中，研究人员对肿瘤浸润CD8+ T细胞进行全基因组体内CRISPR筛选：具体方法包括从小鼠体内分离CD8+ T细胞，利用CRISPR技术进行全基因组编辑，经短期培养后将处理后的T细胞回输至荷瘤小鼠体内，最终通过单细胞测序检测基因表达差异。该研究不仅验证了PD-1等已知免疫治疗靶点的可靠性，还发现了RNA解旋酶Dhx37这一全新靶点。由此可见，高通量体内T细胞筛选技术为快速发现潜在免疫治疗新靶标提供了有效途径。然而，间接体内筛选仍存在显著局限性：小鼠皮下移植的肿瘤细胞显然无法对应人体肿瘤正常发生部位，且不能反映实际肿瘤生长位置；此外，移植细胞的转输效率、细胞系本身与真实肿瘤的差异等因素都会影响筛选过程的真实性。
若将编辑系统直接递送至荷瘤动物模型，施加选择压力后检测基因表达差异，这种方法被称为体内直接筛选。此类模型的肿瘤来源于内源性靶组织，具有真实的肿瘤微环境。研究表明CRISPR编辑系统可直接靶向特定器官：例如通过AAV载体递送SpCas9和单向导RNA，成功实现了成年小鼠脑组织中单个基因（Mecp2）及多基因（Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b）的靶向编辑。后续的小鼠生化、遗传、电生理及行为学实验证实了上述基因组修饰在神经元中的作用，验证了体内直接CRISPR筛选的可行性。该方法同样适用于高通量筛选，例如通过水动力注射将包含147个肝脏疾病相关sgRNA的转座子和Sleeping Beauty转座酶（SB100）质粒递送至小鼠肝脏。通过对肝细胞克隆的持续监测，发现不同sgRNA在Arid1a、Pten、Pkd1和Kmt2d等基因位点呈现持续性富集，这些基因与人类肝脏疾病进展的关键基因高度对应。无独有偶，Zhu团队建立的体细胞AAV-转座子体内克隆筛选（MOSAICS，the method of somatic AAV-transposon in vivo clonal screening）方法，通过向表达Cas9的小鼠注射携带63个非酒精性脂肪性肝炎（NASH，non-alcoholic steatohepatitis）相关基因sgRNA文库的AAV病毒，成功构建嵌合肝组织，筛选出调控脂肪合成的关键基因，其结果与患者来源的测序数据高度吻合。在肿瘤研究领域，体内直接编辑也展现出优越的肿瘤诱导效率：通过气管手术递送靶向癌基因KRAS及抑癌基因p53、LKB1的AAV，可在Cas9转基因小鼠中诱导肺癌发生；采用尾静脉高压注射法同时表达Cas9与靶向Pten、p53等抑癌基因的sgRNA，可成功诱导肝细胞癌（HCC）和肝内胆管癌（ICC）。在高通量肿瘤筛选中，将包含280个sgRNA（靶向56个人类常见肿瘤基因）的AAV病毒文库递送至条件性Cas9小鼠脑部，成功诱发胶质母细胞瘤。测序结果显示目标基因的相对突变频率与人类胶质母细胞瘤数据集中的突变频率显著相关，从而鉴定出B2m–Nf1、Mll3–Nf1及Zc3h13–Rb1等驱动基因组合。不过，直接体内筛选仍存在局限：相较于体外模型更易获得的编辑效率和可控性，体内同时进行编辑与整合过程需平衡肿瘤负荷与sgRNA文库规模——既要保证足够的肿瘤形成压力，又需控制文库规模以避免覆盖度不足导致的编辑效率下降。
CRISPR基因功能筛选技术在肿瘤免疫研究中的应用
自人类基因组计划完成以来，人们对基因功能的理解不断深化，但仍存在诸多待解难题。以免疫系统为例，其组成成分在体内分布广泛且错综复杂，特别是免疫细胞与免疫分子在体内持续经历生成、循环和更新的动态过程，这使得对其具体作用机制的深入解析面临极大挑战，同时也为未来研究提供了广阔空间。通过基因编辑技术开展功能性筛选（包括功能获得型筛选、功能缺失型筛选及功能修饰型筛选），能有效助力未知免疫调控过程的探索。