CRISPR筛选技术解锁肿瘤免疫治疗新靶点
肿瘤免疫学研究中的体外筛选体系
在肿瘤免疫学研究中，二维（2D）培养体系（即培养瓶/皿中单层贴壁生长的细胞）被广泛采用。例如，研究者运用CRISPR-Cas9技术对胶质母细胞瘤（GBM）、视网膜色素上皮细胞（RPE1）、结直肠肿瘤细胞（HCT116、DLD1）、宫颈肿瘤细胞（Hela）和黑色素瘤细胞（A375）等6种肿瘤细胞系进行全基因组基因敲除筛选，鉴定出1580个核心必需基因。基因功能（GO）富集分析显示，这些基因显著富集于DNA转录、翻译、复制及修复功能，其富集浓度超过其他功能基因四倍以上，与细胞生长调控密切相关。值得注意的是，在细胞间信号传导、器官发育及细胞黏附等功能层面，该研究揭示了不同肿瘤细胞系中依赖新发现代谢通路和信号转导通路的重要致癌驱动因子，为未来靶向治疗提供了理论依据。此外，通过将抗CD19 CAR转导T细胞与供体匹配的模拟转导T细胞进行免疫细胞杀伤实验，可有效评估CAR-T细胞的特异性杀伤功能及抗肿瘤免疫治疗效果。研究团队提出并建立的T细胞韧性模型，能够在慢性肿瘤抗原刺激及肿瘤微环境抑制压力下维持功能活性而不发生耗竭。基于抗PD-1免疫治疗实体瘤患者的T细胞单细胞测序数据，研究者发现FIBP可作为T细胞抗肿瘤效应的新型负向标志物及潜在药物治疗靶点，这为预测肿瘤免疫治疗响应和开发新型T细胞免疫疗法提供了创新性研究平台。值得关注的是，在肿瘤微环境中，作为抗肿瘤应答主力军的CD8+细胞毒性T细胞（CTLs）的持续存在能力与增殖能力下降，制约了过继性细胞疗法（ACT，adoptive cell therapy）及免疫检查点抑制剂（ICIs）等免疫疗法的疗效。通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与CRISPR筛选技术，研究者实现了对衰竭前体/祖细胞T细胞（Tpex）和终末耗竭T细胞（Tex）亚群的单基因敲除、转录组分析、功能模块鉴定及精准基因表达调控，从而系统描绘了体内肿瘤T细胞命运调控网络，揭示了驱动Tpex退出静息状态并增强终末Tex增殖状态的关键调控转录因子，为优化肿瘤免疫治疗策略提供了重要理论支撑。
值得注意的是，当肿瘤细胞在平面塑料基质上进行二维培养时，由于缺乏肿瘤-免疫循环（CIC，cancer-immunity cycle）的复杂性和动态交互作用，关键表型特征易发生丢失。同时，培养皿表面的刚性特征会影响细胞的生物物理行为、基因表达谱及药物敏感性，导致免疫治疗响应发生偏差。需要指出的是，肿瘤-免疫循环概念由Chen和Mellman于2013年首次提出，旨在描述免疫系统对抗肿瘤细胞的循环过程，并揭示局部肿瘤病灶与宿主全身免疫系统间的相互作用机制。大量研究表明，肿瘤微环境中的多种组分显著影响机体对恶性肿瘤的免疫应答及免疫治疗效果。因此，建立精准的肿瘤建模方法在肿瘤研究尤其是实体瘤免疫学研究领域具有关键意义。近十年来，三维（3D）体外模型逐渐兴起以克服传统二维细胞模型过度简化的缺陷。最新研发的体外临床前三维模型能够重建复杂的体内肿瘤微环境，并保持原始肿瘤的生物学特性。这类三维体外模型可整合患者来源细胞与基质成分，更真实地反映机体自身遗传信息及药物敏感性等特征。值得关注的是，基于三维肿瘤球体的全基因组CRISPR筛选研究显示，相较于二维条件，三维环境能更精准地揭示肿瘤突变基因的富集特征及其敏感性差异，并发现与二维培养截然不同的三维及体内肿瘤生长驱动因子。类器官作为干细胞衍生的三维微器官，具备自我增殖和自组装能力，可在体外稳定再现真实人体器官的关键功能结构与表型遗传特征。
肠道类器官研究的里程碑始于Hans Clevers团队利用单个LGR5+肠道干细胞成功实现体外自组织形成隐窝-绒毛结构的突破性工作。患者来源类器官（PDOs，Patient-derived organoids）作为重要研究模型，已在结直肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌及肝癌等多种实体瘤研究中获得广泛应用。特别值得关注的是，科研人员通过CRISPR-Cas9筛选技术在肠道类器官中系统研究了上皮细胞成熟过程中的关键调控机制，发现SWI/SNF复合体的核心组分Smarca4和Smarcc1基因作为上皮成熟障碍的关键调控因子，这为揭示组织发育机制提供了新视角。