CRISPR筛选技术解锁肿瘤免疫治疗新靶点
Cas9蛋白具备自主结合并切割靶基因的特性。经点突变改造形成的失活型Cas9（dCas9）虽丧失DNA切割能力，却可通过结合基因转录起始位点阻断转录进程，或通过与转录调控因子互作影响下游基因表达。其独特优势在于能可逆地激活或抑制基因表达（CRISPRa/CRISPRi），且不会引发基因组DNA的永久性改变。当dCas9与转录激活因子（如VPR三重复合体：VP64、P65、Rta）融合时，可显著增强对启动子和增强子区域靶基因的内源性激活效果，其激活效率远优于单一VP64结构域。此外，Cas9 SAM系统通过将sgRNA与MS2发夹结构偶联，可募集MS2-P65-HSF1复合体至dCas9-VP64蛋白，实现内源基因的高效激活。基于CRISPRa的激活筛选系统已成功鉴定出CD274（PD-L1）、MCL1、JUNB和B3GNT2等介导肿瘤细胞抵抗细胞毒性T细胞的关键基因，为阐明耐药通路、定位治疗靶点及提升肿瘤免疫治疗效果提供了新思路。当前，通过CRISPR激活筛选技术开展功能获得性研究，研究者已发现具有抑制NK细胞介导细胞毒性作用的表面分子MUC21，并验证了其免疫抑制功能与作用机制，同时该技术在耐药相关因子鉴定、肿瘤转移相关基因筛选等领域也取得重要进展。
CRISPR抑制（CRISPRi）作为RNA干扰（RNAi）之外的基因转录抑制新策略，其核心在于将sgRNA靶向设计于基因转录起始位点（TSS）附近。为增强dCas9蛋白的转录抑制效果，研究者常将其与KRAB结构域融合，通过表观遗传修饰（如异染色质形成）显著提升基因沉默效率。基于CRISPRi的筛选方法已在黑色素瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤（GBM）等多种肿瘤模型中成功鉴定出关键驱动基因、发育调控因子及免疫应答相关基因，展现出强大的功能筛选潜力。值得关注的是，整合sgRNA慢病毒转导与Cas9蛋白电穿孔技术的SLICE平台（Single guide RNA Lentiviral Infection with Cas9 protein Electroporation），首次实现了人原代T细胞的全基因组规模功能基因筛选。该技术通过全基因组筛选成功定位了调控T细胞增殖的关键靶基因，其敲除可显著增强T细胞的抗肿瘤活性。进一步地，通过优化高滴度腺病毒包装的dCas9-VP64系统，研究者构建了适用于人原代T细胞的大规模CRISPRa/CRISPRi互补筛选平台。该平台通过双模式筛选揭示了IL-2和IFN-γ分泌的基因调控网络，并结合表型分析与单细胞转录组测序（scRNA-seq）深入解析了关键基因的功能特异性，为精准调控T细胞功能及开发新型细胞疗法提供了重要工具。
传统CRISPR筛选技术多局限于细胞增殖、形态学、流式分选等群体水平的表型分析，存在检测通量低、表型维度单一、忽视细胞异质性等局限，难以深入解析复杂多维的基因调控网络。近年来，随着CRISPR基因编辑与单细胞组学技术的融合发展，单细胞CRISPR筛选（scCRISPR）技术通过将基因扰动与单细胞测序深度整合，实现了大规模基因功能筛选与单细胞分辨率表型解析的突破性结合，被誉为解析复杂生物系统基因调控机制的革命性工具。借助先进单细胞多组学平台，scCRISPR不仅能精准定位基因扰动效应，更可系统性揭示细胞状态转换的动态调控网络。例如，应用该技术成功绘制了肿瘤微环境中T细胞命运调控网络，揭示了驱动前体耗竭T细胞（Tpex）退出静息状态及增强终末耗竭T细胞（Tex，terminal exhausted T cells）增殖能力的关键转录因子，为优化肿瘤免疫治疗提供了新靶点。此外，基于CRISPRi与scRNA-seq联用的技术框架，研究者通过单细胞水平感染gRNA文库，在K562细胞系中系统鉴定了664个顺式调控元件，为大规模研究增强子-基因互作及解析未知调控元件功能建立了方法学基础。
自2016年首个整合CRISPR筛选与单细胞转录组测序的Perturb-seq平台问世，scCRISPR技术为解析复杂细胞群体中单基因敲除后的转录调控网络及功能模块提供了全新范式。单细胞转录组读数的引入使得数十个基因的并行扰动分析成为可能，推动了scCRISPR技术的快速发展。迄今已衍生出30余种技术变体，涵盖多组学模态的基因扰动模式与表型输出。值得注意的是，最新开发的"Perturb-map"技术将CRISPR扰动、多模态成像与空间转录组学相结合，创建了空间功能基因组学研究新范式。该技术不仅能保留组织空间结构信息，还可解析Socs1 KO与Tgfbr2 KO肿瘤中TGFβ响应差异对肿瘤微环境（如T细胞浸润特征）的影响，同时拓展了致癌基因筛选的类型与功能维度，为评估基因扰动对肿瘤生长、形态演变及免疫细胞招募的动态影响提供了多维视角。除转录组外，CRISPR功能筛选与蛋白质组学、表观基因组学的深度整合，为从海量基因中精准定位肿瘤免疫耐受、微环境浸润等关键下游调控因子提供了全新研究维度。这些技术融合不仅革新了肿瘤研究的范式，更为未来诊断方法优化及免疫治疗策略升级奠定了技术基础，预示着该领域的持续突破将为人类健康带来更多突破性发现。