CRISPR筛选技术解锁肿瘤免疫治疗新靶点
拓展性基因筛选技术体系研究进展
互补DNA（cDNA）文库通过mRNA逆转录合成双链cDNA并克隆至载体构建而成，其通过宿主细胞扩增后可用于靶细胞基因功能筛选。该技术通过人工诱导靶细胞基因突变，结合表型筛选鉴定特定功能基因。在肿瘤免疫领域，基于表达型cDNA文库的血清学分析（SEREX，serological analysis of expression cDNA libraries）技术已被广泛应用于获取肿瘤特异性抗原，如在黑色素瘤、乳腺癌等模型中发现的抗原分子，为肿瘤免疫治疗与诊断标志物开发提供了重要线索。RNA干扰（RNAi）指由双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默现象，通过特异性敲低或关闭靶基因表达实现功能研究。基于此构建的RNAi文库可通过表型筛选反向定位调控基因，目前已成功鉴定出肿瘤代谢重编程、转移复发及化疗耐药等关键调控因子。但RNAi筛选存在基因覆盖度有限、难以诱导稳定表型改变，且内源性RNAi通路易引发广泛脱靶效应等技术瓶颈，制约了其筛选效率与准确性。
转座子作为基因组中可移动的遗传元件，其通过转座酶介导的"剪切-粘贴"或"复制-粘贴"机制实现基因组位点间迁移，进而调控插入位点基因功能。自首次在线虫中实现转座子插入诱变，至Sleeping Beauty（SB）与piggyBac（PB）转座系统在小鼠及人类细胞中的成功应用，转座子相关遗传筛选技术日趋成熟。在肿瘤研究中，SB系统通过诱导小鼠体细胞高频突变引发肿瘤，进而定位肿瘤相关驱动基因。例如，利用该技术鉴定了肝癌中抑癌基因Ncoa2/Src-2、Pten协同抑癌因子ZBTB20，以及乳腺癌驱动基因FGFR2。而PB系统通过对63例造血系统肿瘤的突变筛查，成功鉴定出Spic等关键致癌基因。相较于CRISPR筛选，传统转座子突变筛选存在覆盖度低的缺陷。但最新开发的AAV-SB-CRISPR联合筛选系统，通过腺相关病毒（AAV）递送SB转座子系统，实现了CRISPR元件在基因组中的稳定整合，显著提升筛选稳定性与准确性。基于该技术的体内筛选已发现增强T细胞抗肿瘤活性的Pdia3基因，以及NK细胞新型免疫检查点CALHM2，展现出强大的应用潜力。
高效筛选新型肿瘤免疫治疗靶点的临床前模型体系
构建合适的临床前药效研究模型能够加速免疫治疗药物研发及新型治疗组合的开发，从而降低临床试验失败风险。现有临床前模型在肿瘤治疗与免疫治疗研究中已取得多项关键发现，包括免疫检查点的抗肿瘤效应研究。然而需要指出的是，现有临床前模型尚无法完整复现人类肿瘤免疫的特征本质，其在免疫细胞组成、肿瘤微环境（TME）以及肿瘤免疫抗原呈递等方面仍存在显著差异。当前最常用的临床前肿瘤模型构建手段是肿瘤细胞系异种移植，但接种的肿瘤细胞系通常难以复现肿瘤免疫微环境中的免疫细胞抗原应答特征。更为重要的是，人体内肿瘤往往呈现长期持续性发展，这使得肿瘤免疫应答具有时序演变特性。因此，基因工程小鼠模型（GEMMs，gene-engineered mouse models）被认为是目前最能准确表征人类肿瘤疾病特征的模型体系。值得关注的是，随着研究的深入，类器官、人源化小鼠及肿瘤微环境模拟模型等临床前肿瘤模型的定义标准也在持续演进。在此背景下，选择临床前肿瘤模型时需充分考量模型保真度，力求最大程度模拟人类肿瘤及其免疫环境的核心特征，从而确保筛选出稳定且可重复的免疫治疗靶点。