CRISPR筛选技术解锁肿瘤免疫治疗新靶点
在CD4+ T细胞研究领域，这类免疫应答关键组分可分为辅助性T细胞（Th1/Th2/Th17）和调节性T细胞（Treg）等多个亚群，通过分泌特定细胞因子发挥调控协调功能。功能性筛选中，研究者在原代小鼠Th2细胞内引入CRISPR敲除文库，以Gata3、Il4等标志物为读数，通过sgRNA丰度分析揭示了Th2辅助细胞命运调控的核心网络。该研究首次应用CRISPR技术实现原代小鼠T细胞功能筛选，鉴定出Pparg等影响Th2分化的关键基因。值得注意的是，在ACT治疗中联合应用CD4+ T细胞可增强肿瘤部位疗效，但移植后抗原经历型（Ag-exp）CD4+ T细胞常出现增殖抑制现象。Menger团队通过全基因组CRISPR筛选发现SOCS1基因通过调控多条下游通路抑制CD4+ T细胞增殖与效应功能，而抑制SOCS1可显著增强CAR-T细胞在白血病模型中的抗肿瘤反应。更值得关注的是，CD4+ T细胞可通过诱导炎性细胞死亡独立于CD8+ T细胞促进肿瘤免疫逃逸，这一发现揭示了肿瘤免疫治疗的重要调控节点，为高通量筛选技术的应用拓展了新方向。
目前基于不同CRISPR筛选平台，研究者已在荷瘤小鼠模型中完成多项T细胞相关功能基因筛选，取得系列重要发现：RNA解旋酶Dhx37的敲除可增强抗体特异性CD8+ T细胞对三阴性乳腺癌的体内疗效；调控甲羟戊酸-胆固醇代谢通路的转录因子SREBP2能提升CD8+ T细胞线粒体呼吸能力，促进感染和肿瘤状态下组织驻留记忆CD8+ T（TRM，tissue-resident memory CD8+ T）细胞的体内蓄积；经典Brg1/Brg相关因子复合物（cBAF）作为Tmem命运的负向调节器，早期抑制其活性可增强肿瘤免疫治疗效果；SEC31A基因缺失通过影响mTORC1通路损害T细胞活化及Treg抑制功能；转录因子Fli1通过RUNX介导的转录抑制和染色质闭合机制强力抑制CD8+效应T细胞扩增，其作用机制独立于PD-1通路，具备成为新型免疫检查点的潜力；磷脂酰乙醇胺（PE，Phosphatidylethanolamine）通过调控ETNK1等节点基因影响滤泡辅助T细胞分化进而调节体液免疫；氨基酸转运体SLC7a1和SLC38a2作为Tmem负调控因子，其部分机制也通过调节mTORC1活性实现。
在人类T细胞研究层面，Marson团队构建的高效腺病毒载体dCas9-VP64转导效率达80%，成功实现人原代T细胞全基因组CRISPRa/i筛选。通过IL-2/IFN-γ表达水平分选，CRISPRi筛选鉴定出MALT1等促炎因子表达基因，而CRISPRa筛选则发现4-1BB等肿瘤坏死因子超家族受体能增强细胞因子分泌。该研究建立的筛选平台结合单细胞测序技术，为优化肿瘤细胞疗法提供了重要靶标网络。新一代过继性细胞疗法通过SLICE技术敲除SOCS1等免疫检查点基因，甚至重构内源基因组序列，其中RASA2等基因的缺失可显著增强T细胞抗肿瘤反应。随着筛选范围的拓展，更多潜在治疗靶点将推动肿瘤治疗策略的创新。
肿瘤免疫治疗靶点筛选研究进展
现有研究表明，CRISPR筛选技术已广泛应用于肿瘤研究领域，在细胞增殖、代谢调控、耐药机制、转移特性以及合成致死效应等方面取得重要发现。在肿瘤免疫应答研究方面，通过揭示肿瘤细胞内调控抗肿瘤免疫的关键分子，不仅能提升现有免疫治疗效果，还可为新型治疗靶点开发提供方向。以黑色素瘤细胞系Mel624为例，研究团队创新性采用"双细胞型"(2CT)-CRISPR技术，以T细胞为效应细胞、肿瘤细胞为靶细胞进行全基因组敲除筛选。通过整合TCGA数据库分析，系统鉴定出包括APLNR（编码apelin受体蛋白基因）在内的免疫治疗相关"必需基因"，这些基因可增强T细胞对肿瘤细胞的识别清除能力。该研究从肿瘤层面深入解析免疫治疗耐药机制，为靶点研发提供了新思路。
在多瘤种模型（乳腺癌4T1/EMT6、结直肠癌CT26/MC38、肾癌Renca、黑色素瘤B16）中，研究者针对19,069个蛋白编码基因开展全基因组CRISPR筛选。通过比较T细胞存在与否条件下肿瘤细胞增殖差异，结合迭代筛选策略和TCGA数据比对，最终锁定182个参与肿瘤免疫逃逸的关键基因。值得注意的是，自噬相关基因Fitm2的缺失显著影响肿瘤细胞对T细胞攻击的敏感性。该研究系统性绘制了肿瘤免疫逃逸相关基因图谱，为免疫治疗策略创新奠定基础。本案例通过多轮CRISPR筛选与临床数据交叉验证，成功构建了从肿瘤细胞复杂基因网络中筛选免疫关键基因的研究范式。
在ICI治疗领域，抗PD-1疗法虽在多种肿瘤中疗效显著，但其作用机制仍需深入解析。O'Donnell团队在NCI-H358肺肿瘤细胞系中开展全基因组CRISPR/Cas9筛选，采用荧光标记PD-L1抗体检测发现：翻译起始因子eIF5B通过整合应激反应(ISR)通路调控PD-L1翻译，该因子在肺腺癌中高表达且与不良预后相关。值得注意的是，PD-L1表达与IFN-γ信号密切相关，后者通过直接或间接途径发挥抗肿瘤作用。为探究IFN-γR1表达的调控网络，研究者在黑色素瘤细胞系中进行全基因组CRISPR筛选，发现E3泛素连接酶STUB1通过介导IFN-γ-R1/JAK1复合体降解导致肿瘤对IFN-γ敏感性降低，提示STUB1抑制剂或可增强ICI疗效。然而，最新研究显示IFN-γ信号在特定模型中可能诱导MHC-I抑制性检查点基因表达上调，促进NK细胞和CD8+T细胞功能抑制。该研究运用CRISPR技术对黑色素瘤、胰腺癌等模型进行体内外高通量筛选，证实Qa-1b/NKG2A抑制轴在免疫逃逸中的核心作用，为免疫治疗耐药机制提供了新见解。