CRISPR筛选技术解锁肿瘤免疫治疗新靶点
CRISPR/Cas9在不同类型免疫细胞中的工程化应用
树突状细胞（Dendritic cells, DCs）自1973年Steinman和Cohn在小鼠脾脏中发现以来，因其成熟时呈现大量树突状或伪足状突起而得名，是目前已知功能最强大的抗原呈递细胞。在首个针对DC来源的原代免疫细胞开展的全基因组CRISPR筛选中，研究者利用脂多糖（LPS）刺激基因编辑小鼠的原代骨髓DCs，通过肿瘤坏死因子（TNF）诱导表达水平筛选目标基因。该研究以TNF高/低表达水平为读数指标，将DCs分为差异对照组，经流式分选并监测两组群体中sgRNA分布后，通过两轮渐进式筛选锁定三个调控TNF的功能模块：包括已知的Toll样受体4（TLR4；LPS受体）通路组分，以及寡糖基转移酶（OST，oligosaccharyltransferase）复合物和聚合酶相关因子（PAF，polymerase-associated factor）复合物。值得注意的是，另有研究团队从小鼠骨髓源DCs中分离出稳定表达CAS9蛋白的细胞系，在体外实施全基因组CRISPR筛选，并利用流式分选技术筛选CD86高表达且PD-L1低表达的细胞进行sgRNA测序分析。基于测序结果开展第二轮筛选验证，最终发现DCs中分别有118个和150个基因对CD86和PD-L1具有负向/正向调控作用，其中6个基因被鉴定为双重调控因子，最终验证了CEBPE和Med12等关键基因对DCs抗原呈递能力的核心调控作用。在人类DCs编辑领域，研究者开发了针对人单核细胞源性DCs（moDCs，monocyte-derived DCs）的CRISPR-Cas9基因组编辑方法，在超过300个基因的敲除中实现了>94%的中位效率。应用该方法开展moDCs基因筛选，进一步阐明了DCs在人类微生物组脂多糖反应中的调控机制。
循环系统中的单核细胞与体腔/组织驻留的巨噬细胞均来源于骨髓干细胞，因其具有强吞噬能力且细胞核无分叶特征，共同构成单核吞噬细胞系统。其中单核细胞源性巨噬细胞作为重要的抗原呈递细胞，在特异性免疫应答的诱导与调控中发挥关键作用。作为先天免疫系统的专职细胞，巨噬细胞具有寿命长、吞噬活性强等特点，通过识别、吞噬和降解细胞碎片及病原体参与免疫防御，构成抵御病原体的第一道防线。在适应性免疫中，巨噬细胞通过抗原呈递启动适应性免疫应答，同时在炎症早期通过释放细胞因子和趋化因子募集其他免疫细胞至炎症部位。巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用亦是抗肿瘤免疫的重要途径，其表型可大致分为LPS与IFN-γ激活的促炎型巨噬细胞（M1样）和IL-4/IL-10诱导的替代激活型巨噬细胞（M2样）。基于巨噬细胞的肿瘤免疫治疗核心目标在于促进促炎型巨噬细胞（M1）分化，而该过程的关键分子有望成为抗肿瘤免疫治疗的潜在靶点。Zhang团队通过CRISPR筛选人类代谢基因文库靶向THP-1细胞，诱导其分化为巨噬细胞后，基于M1极化标志物CD80表达水平进行测序分析，成功鉴定出调控巨噬细胞促炎极化的关键代谢基因。体内外实验证实，敲除KEAP1显著抑制巨噬细胞促炎极化，而敲除ACOD1则显著增强其促炎特性，这为第二代iPSC来源的CAR-巨噬细胞（CAR-iMAC）改造提供了新思路。ACOD1可作为巨噬细胞肿瘤免疫治疗的新靶点，在实体瘤治疗中展现出临床应用潜力。需要指出的是，上述研究均基于单核细胞系（如U937和THP-1），尽管这些细胞经诱导可分化为类巨噬细胞，但其诱导分化的巨噬细胞在增殖能力方面存在显著缺陷，不适用于细胞增殖相关筛选。为解决这一问题，有研究通过慢病毒gRNA文库转导Rosa26-Cas9敲入小鼠的巨噬细胞，靶向近20,000个小鼠基因和1,000个非靶向对照gRNA，将78,637个gRNAs转导至分离的小鼠骨髓（BM）细胞后，采用L细胞条件培养基联合巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化为原代小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）。最终通过测序验证发现了与小鼠体内有效吞噬及人原代巨噬细胞体外吞噬功能相关的新关键基因Wdfy3。
在肿瘤免疫微环境中，大量存在的髓系来源抑制细胞通过抑制免疫应答构成了当前免疫疗法的重要障碍。其中，病理性活化的中性粒细胞（即多形核髓系来源抑制细胞，PMN-MDSCs，polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells）作为免疫抑制微环境的关键组成单元，展现出强大的淋巴细胞抑制功能。通过CRISPR筛选技术，研究团队发现了PMN-MDSCs表面起核心调控作用的功能性受体CD300ld，该受体是介导肿瘤免疫抑制的关键分子。阻断CD300ld不仅能减少PMN-MDSCs的募集聚集，还可显著削弱其免疫抑制功能，从而将免疫微环境从抑制状态重塑为活化状态，最终实现广谱抗肿瘤效应。