相分离在CAR-T中的功能与应用
细胞生物学领域的核心科学问题之一是探索单个细胞过程如何在特定亚细胞区室中实现空间区隔化调控。T细胞受体(TCR)信号通路的激活机制为此提供了典型范例。研究表明，TCR信号通路近膜区域的关键组分（包括TCR复合体、共受体分子、激酶及接头蛋白等）能够在质膜表面形成动态的微簇结构（microclusters）。这种空间组织特征表明，信号转导并非依赖均匀分布的膜蛋白，而是通过微簇结构作为功能单元来完成的。近年研究揭示，接头蛋白LAT通过液-液相分离机制与其结合伴侣Grb2、Sos1、PLCG1等形成生物分子凝聚体。这些凝聚体不仅选择性富集激酶组分并排斥磷酸酶，从而显著增强酪氨酸磷酸化水平（TCR通路的核心信号事件），还能通过延长Sos1等酶分子的膜驻留时间解除其自抑制状态，最终激活Ras信号通路。
除LAT外，TCR复合体的CD3ɛ亚基与激酶Lck形成的相分离凝聚体也具有重要调控功能。Lck介导的CD3ɛ磷酸化可招募抑制性激酶Csk，通过负反馈机制精确调控信号强度。这些发现为人工设计的嵌合抗原受体（CAR）优化提供了重要启示。CAR作为一种合成受体，能够使T细胞特异性地靶向肿瘤。虽然CAR的核心信号域来源于TCR的CD3ζ亚基，但其在抗原识别敏感性和免疫突触有序性方面显著弱于天然TCR。针对这一缺陷，Xu团队创新性地将TCR的CD3ɛ结构域引入CAR设计中。实验证实，CD3ɛ的加入不仅能促进CAR分子在突触部位的凝聚，还能显著增强ZAP70激酶的募集效率。然而，该设计同时导致CAR在细胞膜表面定位减少。为克服此问题，研究人员通过将调控内吞作用的脯氨酸富集基序替换为柔性连接肽，成功开发出新型EB6I CAR。该改良型CAR在维持相分离能力的同时显著提高了膜表面表达水平。
功能验证实验显示，EB6I CAR对CD19低表达的肿瘤细胞展现出显著增强的杀伤能力，并在长期暴露于血液肿瘤细胞时表现出更低的耗竭特征。机制研究表明，这些优势可能与CD2-PI3K信号通路的激活增强以及CD3ɛ介导的Csk招募有关——后者可通过调控细胞因子分泌来延缓T细胞耗竭。在小鼠异种移植模型中，EB6I CAR-T细胞对复发性CD19阳性肿瘤及以间皮素为靶标的实体瘤模型均显示出卓越的抗肿瘤活性。这些数据充分证明，经过工程化改造的CD3ɛ结构域可作为多功能调控元件，通过相分离介导的信号转导优化和效应分子动态调控的协同作用，显著提升CAR-T细胞针对多种肿瘤类型的治疗效果。值得注意的是，CD3ɛ诱导的凝聚体形成可能与其招募下游效应分子（如PI3K和Csk）并调控其活性的经典功能形成互补，这种双重作用机制为未来CAR-T的理性设计提供了新的方向。
除了CD3ɛ结构域外，其他功能性基序也被证实能够通过促进嵌合抗原受体（CAR）凝聚体的形成来增强抗肿瘤效应。近期，Su研究团队的重要工作揭示，经典的固有无序区（intrinsically disordered regions, IDRs）——包括RNA结合蛋白FUS、EWS和TAF15中的IDR结构——可作为高效调控元件显著提升CAR分子的相分离能力。实验数据显示，将上述IDR序列整合至CAR胞内结构域后，能够有效增强近膜信号传导事件：包括CD3ζ亚基和接头蛋白LAT的磷酸化水平显著升高，进而提升CD19、CD22及HER2靶向CAR-T细胞的细胞因子分泌能力、体外杀伤活性以及体内抗肿瘤效果。值得注意的是，这些IDR蛋白本身并不参与天然T细胞的信号转导，其功能增益主要源于促进CAR分子凝聚体的形成而非直接调控信号通路。这一突破性发现突破了传统CAR设计中局限于T细胞信号蛋白的改造思路，为利用跨细胞类型的相分离元件优化CAR-T功能开辟了新途径。
不同序列元件（如CD3ɛ、FUS、EWS和TAF15）均能通过促进凝聚体形成增强CAR-T疗效，这一共性特征强有力地支持"相分离调控"可作为提升CAR-T抗肿瘤效力的普适性策略。更令人兴奋的是，当前相分离领域积累的丰富理论模型和定量分析手段（如相图预测、黏弹性表征等）为工程化设计提供了全新可能。未来研究有望通过精确调控凝聚体的相变阈值、物质交换速率等物理化学特性，构建模块化的序列工具库，从而根据个体化治疗需求（如抗原敏感性调控、信号强度梯度设计）对CAR-T功能进行"可编程式"优化。
需要特别指出的是，CAR分子的聚集化过程可能存在多种机制：除胞内IDR介导的液-液相分离外，近期研究发现抗原结合域表面带正电荷的斑块（positively charged patches）也能通过静电作用诱导CAR簇形成。然而，这两种聚集模式对细胞功能的影响截然不同：IDR介导的凝聚体不会引发抗原非依赖性的本底信号激活（tonic signaling），而电荷斑块诱导的簇结构则会导致显著的持续性信号传导，进而加速T细胞耗竭。这种功能差异提示我们亟需在物理化学层面深入解析两类聚集体的本质区别——它们是否分别对应液态凝聚体与固态聚集体的不同物质状态？二者如何通过差异化的分子排布方式影响下游信号通路的时空动态？对这些关键问题的解答不仅能够深化对CAR-T功能调控机制的理解，也将为新一代智能化CAR设计提供重要理论依据。