相分离凝聚体驱动RAS激活与耐药
尽管以致癌基因为靶点的精准治疗药物研发及临床应用已取得显著进展，肿瘤耐药性仍是阻碍多数肿瘤患者获得长期生存的主要挑战。肿瘤细胞通过多种适应性机制对抗治疗压力维持存活。作为重要的治疗靶点，MAPK信号通路包含RAS、RAF、MEK和ERK等多个可靶向的信号蛋白。值得注意的是，直接抑制RAS蛋白的研发突破堪称肿瘤生物学和临床治疗领域的里程碑，但与其他靶向治疗类似，RAS抑制剂也面临耐药性产生的困境。
近期一项创新性研究揭示了肿瘤细胞抵抗RAS靶向治疗的新机制：研究团队发现RAF家族成员ARAF可通过在细胞膜形成相分离凝聚体，实现对RAS蛋白的捕获与激活。这种由活化态RAS与ARAF共同组成的凝聚体能保护RAS免受NF1等RAS GAP蛋白的负调控作用。RAF蛋白家族（包括A-、B-和CRAF）作为RAS主要效应蛋白，是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，负责MAPK通路中MEK的磷酸化过程。三种RAF蛋白均具有三个保守结构域：N端至C端依次为包含RAS结合域（RBD，RAS-binding domain）和富含半胱氨酸结构域（CRD，cysteine-rich domain）的CR1结构域、可结合14-3-3调控蛋白的CR2结构域，以及含有激酶结构域（KD，kinase domain）的CR3结构域。RAF蛋白需形成同源或异源二聚体才能激活下游MEK。
传统观点认为，相较于BRAF和CRAF，ARAF的激酶活性较弱。Li及其团队突破性提出，独立于激酶活性之外，ARAF通过独特的相分离机制调控RAS活化及其下游信号传导。研究发现仅ARAF能与RAS在细胞膜形成特征性点状结构。尽管RAF蛋白在表皮细胞分化过程中或经RAS-GTP激活后会发生胞质与细胞膜间的动态定位迁移，但ARAF对细胞膜的定位偏好可能与其N端结构特性相关。既往研究表明，由于空间位阻效应，ARAF较短的N端与其催化结构域的结合力强于其他RAF亚型，这种特性可能赋予ARAF独特的调控功能。研究证实，ARAF的N端结构域是介导RAS膜聚集的关键要素：其N端及RBD结构域（而非KD结构域）参与凝聚体形成，提示该过程不依赖激酶活性。值得注意的是，N端结构域突变体仍保留RAS结合能力，表明该结构域并非介导蛋白互作的关键。
为探究RAS在凝聚体形成中的作用，研究者通过拉帕替尼（HER2抑制剂）和SHP099（SHP2抑制剂）处理经ARAF-GFP标记的SKBR3乳腺肿瘤细胞（p53突变型/HER2扩增型），发现抑制RAS活化可显著减少ARAF凝聚体，证实其形成依赖活化态RAS。活细胞成像显示EGFR、GRB2和SOS1共定位于凝聚体，而MEK、14-3-3和AKT无共定位，提示该过程具有选择性组装特征。
通过结构域替换实验发现，将BRAF/CRAF的N端替换为ARAF同源序列可增强其凝聚体形成能力（BRAF尤为显著，CRAF略有提升），反之替换ARAF的N端则降低其成斑能力（granule formation）。但单独表达ARAF N端无法诱导RAS聚集，表明其N端含有成斑必需但非充分的结构元件。进一步结构分析揭示，相较于其他RAF亚型，ARAF N端具有更高的无序性，这种独特的结构特性可能与其介导细胞膜RAS聚集的功能密切相关。
已有研究表明，ARAF能够阻断RAS GAP蛋白NF1与RAS的结合及失活作用。基于此，研究团队进一步探究ARAF通过形成膜相分离凝聚体是否在空间上阻碍NF1接触RAS。实验结果显示NF1与ARAF在亚细胞定位上呈显著负相关，提示ARAF凝聚体可能通过物理阻隔机制将NF1排斥于RAS活性位点之外。当过表达具有凝聚体形成能力的ARAF变异体时，细胞膜上活化态RAS水平显著升高；而改造后的无凝聚体形成能力的ARAF变异体则无法产生此效应。值得注意的是，通过基因工程手段迫使凝聚体缺陷型ARAF变异体发生聚集后，其恢复了对RAS活化的增强作用。
目前临床应用的泛RAF抑制剂通过抑制RAF家族激酶活性来治疗RAS驱动型肿瘤。但本研究揭示ARAF促癌功能不依赖激酶活性，提示ARAF-RAS-GTP凝聚体的形成可能是泛RAF抑制剂耐药的重要机制。实验验证显示，缺乏凝聚体形成能力的ARAF变异株对RAF二聚化抑制剂更为敏感，而体内ARAF基因敲除同样增强肿瘤对泛RAF抑制剂治疗响应，这些证据为临床转化提供了有力支持。
研究团队进一步探索该机制在激素驱动型肿瘤治疗抵抗中的普适性。通过分析乳腺癌抗雌激素治疗与前列腺癌抗雄激素治疗模型发现，受体酪氨酸激酶（RTK，receptor tyrosine kinase）通路活化介导的耐药过程中，ARAF起着关键调控作用。受体激动剂刺激可诱导ARAF介导的信号通路异常活化，而基因敲除ARAF能使肿瘤细胞重新对靶向治疗敏感。
Li团队的研究为ARAF在RAS信号通路的独特功能提供了全新视角：与BRAF/CRAF不同，ARAF通过激酶非依赖性方式形成保护性凝聚体，阻碍NF1对RAS的抑制作用以维持下游信号传导。这一发现具有多重科学价值：其一，ARAF在表皮细胞分化过程中呈现膜定位特征，暗示相分离机制可能参与正常发育调控；其二，揭示RAF家族进化过程中功能分化的可能机制，即ARAF通过上游调控模式开启信号通路；其三，明确ARAF活性可作为预测靶向治疗疗效的生物标志物，并为克服耐药提供新型干预靶点；其四，拓展了相分离在信号转导及肿瘤生物学中的功能认知，推动该前沿领域发展。