液体活检DNA甲基化标志物在肿瘤诊治中的实践与挑战
总之，靶向方法的选择可能影响生物标志物测试实现临床效用的潜力。各种方法在灵敏度和对常规使用的适用性上各不相同，各有优缺点。无论采用何种方法，在整个流程中进行严格的质量控制、优化和标准化，对于产生可在临床试验中验证的稳健且一致的甲基化结果至关重要。
证明分析有效性、临床有效性和临床效用
美国国家医学院（The National Academy of Medicine）建议，肿瘤生物标志物在证明具有分析有效性和临床效用之前，不应在常规实践中使用。分析有效性定义为“检测方法准确、可重复、可靠地检测和测量目标生物标志物存在的能力，且具有统计学显著性”。评估分析有效性的关键指标包括灵敏度、特异性、准确性和稳健性，这些应使用代表真实临床环境的样本进行评估。所需的分析性能取决于预期的临床用途，例如普通人群筛查、高风险人群监测、治疗反应预测或复发检测。对于用于高风险人群的生物标志物，通常优先考虑更高的灵敏度，而对于普通人群筛查，更高的特异性至关重要。
临床有效性指的是“检测方法能够根据结果（如是否存在肿瘤和治疗反应），以统计学显著性将一个群体划分为两个或更多组的能力”。虽然大多数生物标志物最初以连续变量形式测量，但临床决策通常依赖于设定阈值或临界值。这些阈值的验证需要评估灵敏度、特异性、阴性预测值（NPV）、阳性预测值（PPV）以及阳性和阴性似然比（LR+, LR−）等参数。回顾性和前瞻性患者样本系列均可用于临床验证，优先使用与发现系列独立且设盲的样本系列。稳健临床验证所需的样本量取决于若干因素，包括生物标志物的预期用途和所需的测试性能（例如准确性、灵敏度、特异性）。此外，纳入的患者特征应优先反映目标人群以确保适用性。许多证明了生物标志物临床有效性但未能确立其临床效用的研究，依赖于在收集时未特定考虑生物标志物预期用途的便利样本。
要确立临床效用，生物标志物必须具备高分析有效性和临床有效性，并证明在指导临床策略时能改善患者结局。如果一个新的生物标志物未能改善患者结局，也未能证明其价值超越临床已用的现有测试和生物标志物，它可能永远无法进入临床实施。证明临床效用最可靠的方法是通过把握度高的前瞻性临床试验，这些试验可以作为观察性研究（测试不指导患者管理）或干预性研究（测试指导患者管理）进行。在罕见肿瘤中，通过把握度高的临床试验进行验证可能具有挑战性。在这种情况下，较小规模或适应性试验，可能使用替代终点，可能是合适的。此外，临床效用可以通过使用先前进行的前瞻性试验中收集的存档标本进行前瞻性-回顾性研究来评估。在这种情况下，建议至少纳入来自两个独立临床试验的数据集以加强研究结果的有效性。无论采用何种设计，选择准确反映液体活检检测预期临床应用目标人群的患者群体，将有望增加观察到的生物标志物准确性也适用于真实世界场景的机会。
总结
将生物标志物从实验室成功转化到临床，受到多种因素的影响。液体活检来源的类型会显著影响检测的准确性。选择时应遵循一个基本原则：准确生物标志物的灵敏度通常与所分析的ctDNA拷贝数成正比——分析的拷贝越多，灵敏度越高。对于许多肿瘤而言，邻近体液中的ctDNA浓度高于血液。因此，针对特定肿瘤，使用局部体液作为活检来源可能比血液检测表现更优。同样重要的是，在发现阶段就需考虑是使用组织样本还是直接使用液体活检样本，因为这会影响最终测试的准确性。在组织样本中灵敏度高的生物标志物，在液体活检中未必表现同样出色。尽管已有成功的液体活检标志物源自组织研究，但在发现阶段就直接使用液体活检样本，可能会提高最终标志物的准确性，并最大化开发出具有临床影响力和相关性的生物标志物的机会。
基于测序和基于微阵列的发现方法各有其局限性和优势。方法的选择取决于多种因素，包括可用资源、成本以及预期的下游分析或验证方法。与测序方法相比，微阵列能够以更低成本分析更多样本，传统上曾是首选方法。但需注意，将微阵列发现的标志物转化为靶向分析可能较为繁琐，而基于测序方法发现的候选标志物则能更轻松地开发成基于PCR的检测方法进行验证，这类PCR检测后续也相对容易投入临床使用。此外，近年来测序成本持续下降，未来这一趋势很可能延续，这将促进NGS方法乃至第三代测序（如纳米孔测序）在生物标志物发现以及作为直接临床应用的靶向检测组合中的应用。
无论选择何种方法，在发现和验证阶段，选择能够准确代表目标患者群体的、合适的临床病例和对照组都至关重要。未能纳入相关对照组可能导致原始研究发现难以复现，使得生物标志物在实际研究人群中进行测试或评估时准确性降低。