液体活检DNA甲基化标志物在肿瘤诊治中的实践与挑战
用于分析测序数据的优化生物信息学流程可能会增加发现合适生物标志物的可能性。肿瘤与对照之间的差异甲基化区域（DMRs）被认为是前景广阔的候选生物标志物。与单个CpG位点相比，DMRs提高了后续靶向验证分析的稳健性，例如，BladMetrix生物标志物组合在尿液检测膀胱癌的灵敏度达92%，特异性达93%。尽管测序方法具有诸多优势，但其高成本仍是在生物标志物发现阶段使用大样本队列的障碍。这可能部分解释了为何目前基于液体活检的DNA甲基化生物标志物组合中，源自测序发现的数量少于成本效益更高的基于阵列的方法。然而，测序成本的持续下降和技术的改进，加上生物信息学能力的增强，可能会鼓励更多地使用基于测序的方法进行液体活检生物标志物发现及其在临床环境中的直接应用。
生物标志物发现方法通常旨在检测DNA甲基化水平显著高于对照病例所设定阈值的候选标志物，从而稳健地区分肿瘤病例与对照。这种区分在血浆或血清样本中尤为重要，因为其信噪比可能很高。因此，对照组的选择直接影响生物标志物测试的特异性，并应受测试预期临床应用的指导。癌旁非恶性组织或健康个体样本常在发现阶段用作对照。然而，使用表现出与肿瘤患者相似症状的个体样本可能提供更具临床相关性的对照。此类对照有助于确保生物标志物测试能够准确区分肿瘤与其他具有重叠临床表现的疾病，从而提高可靠性。例如，Hlady等人使用肝硬化患者（肝癌高风险人群）的血浆样本识别出肝细胞癌的候选生物标志物。类似地，血尿患者（膀胱肿瘤状，但也见于其他泌尿系统疾病）的样本常被用作膀胱癌检测的对照。对于某些肿瘤，纳入解剖结构相邻器官肿瘤患者的对照样本可能有益。这种方法使测试不仅能够区分癌组织与正常组织（肿瘤特异性），还能区分不同类型的恶性肿瘤（肿瘤类型特异性）。例如，在旨在从尿液中肿瘤DNA检测膀胱癌的研究中，前列腺癌和肾癌患者可作为有用的对照。重要的是，对于存在增加肿瘤发生风险的炎症性病变的肿瘤，将患有此类炎症的个体纳入对照组至关重要，例如使用原发性硬化性胆管炎或巴雷特食管的样本分别用于发现胆管癌和食管腺癌的生物标志物。最后，由于DNA甲基化通常随年龄增长而增加，在DNA甲基化研究中，年龄匹配的对照尤为重要。
CxBladder测试提供了一个关于正确选择对照组重要性的启发性例子。尽管Cxbladder最初在膀胱癌无创检测方面显示出前景并进入临床实施，但较高的假阳性率最终降低了其阳性预测值，导致其在美国失去了医疗保险报销资格。回顾性分析显示，验证研究未纳入非尿路上皮恶性肿瘤或炎症性尿路疾病患者组。此案例说明了缺乏重要对照如何削弱临床有效性并阻碍有前景的生物标志物检测方法的成功转化。
零背景生物标志物
发现对照样本中背景信号为零的肿瘤生物标志物，已成为一种高精度的血液检测方法，并已在多项研究中成功应用。这一策略对于早期肿瘤尤其有利，因为此时释放到血液中的ctDNA量极少。Feber等人识别出膀胱癌的候选生物标志物，在正常尿路上皮、血液和非癌尿液中显示无或极低的甲基化信号；而Draškovič等人则识别出多种肿瘤类型的候选DMRs，这些DMRs在健康个体的cfDNA中未甲基化。此外，商业化的用于检测结直肠癌复发的ColveraTM测试也利用了在健康个体血浆中无背景信号的DNA甲基化生物标志物。零背景方法不同于传统策略，后者基于对照组中的背景信号设定阈值来对样本进行二分法分类。尽管基于阈值的方法在研究中普遍使用，但可能风险在于过滤掉真实但微弱（低水平）的肿瘤来源信号，可能导致假阴性。调整发现流程，优先选择在对照中背景信号为零或极低的候选生物标志物，可减少验证过程中的干扰，从而 potentially 提高肿瘤检测的灵敏度和准确性。
总之，成功发现液体活检DNA甲基化生物标志物需要优化的研究设计、谨慎的样本类型选择、严格的分析前程序以及使用先进的分子和生物信息学技术。将液体活检肿瘤源性物质整合到发现阶段、应用灵敏的全基因组方法以及选择具有临床信息的对照组，都有助于提高诊断准确性和潜在效用。优先考虑零背景信号生物标志物的方法也可能改善有前景候选标志物向稳健临床测试的转化。
靶向生物标志物分析
为了成功地将候选生物标志物从大规模发现转化为适合临床常规的检测方法，需要足够灵敏、稳健、快速且成本效益高的靶向方法和检测手段。