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分子生物学实验技术复习资料
华北理工大学医学信息平台 2014-07-15 来源: 原创 点击数:6578
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1. 比较Southern,Northern,Western实验操作步骤的区别
Southern杂交
主要用于分析DNA,也包括正向杂交,反向杂交,斑点杂交
正向Southern杂交是将待测DNA固定在纤维膜上,用特异序列RNA探针与其杂交,再显影观察。
反向Southern杂交是将特异序列RNA固定在纤维膜上,用待测DNA做成探针与其杂交,再显影观察。
Northern杂交
主要用于分析RNA,包括正向杂交,反向杂交,斑点杂交
正向Northern杂交是将待测RNA固定在纤维膜上,用特异序列DNA探针与其杂交,再显影观察。
反向Northern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上,用待测RNA做成探针与其杂交,再显影观察。
Western杂交
主要用于分析蛋白质,利用了抗原抗体特异性结合的原理。分为抗原法,夹心法,竞争法
抗原法是将待测抗原固定在膜上,加特异抗体与其结合,洗膜,显色,观察
夹心法是将一抗固定在膜上,加待测抗原,洗膜,加特异二抗,洗膜,显色,观察
竞争法是分对照和试验两组,对照组将特异抗原固定在膜上,实验组将待测抗原固定在膜上,都加入特异抗体,显色,观察。用于比较抗原的特异性。
Southern 和Northern原理基本相同,都是利用DNA或RNA的复性过程,但过程上也有区别,主要是Southern是先电泳后变性,而Northern是先变性后电泳,RNA是单链分子必须消除局部区域的二级结构,在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小,所以使用变性胶; Southern是碱变性,而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性,因为采用碱变性会导致RNA水解
Southern Blotting和Northern Blotting时使用带有标记(如同位素标记或荧光标记)的DNA或RNA探针去识别并结合到待检测核酸上,然后直接显影;而Western Blotting时要先用待检测蛋白的“一抗”结合到待检测蛋白上,再用可识别“一抗”并偶联了某种酶的“二抗去检测”一抗“,最后通过显色反应的信号来显示待检测蛋白的存在与否及量的多少。
2. 如何利用CHIP技术研究一个新发现的组蛋白修饰的生物学功能
   染色质免疫沉淀技术:是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。基本原理是在活性状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目前片段的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
3. 如何确定一个基因的启动子及其调控原件
 
4.3C技术的基本原理是什么
    染色质构象捕获技术(Chromosome Conformation Capture, 3C)利用PCR定量来分析染色质高级构象,通过测定不同DNA片段之间的连接频率来推测染色质的高级结构。该技术已经被广泛应用在检测染色体内部启动子与其顺势调控元件(例如增强子等)之间所形成的染色质环等高级结构。3C技术路线为:福尔马林瞬时固定细胞核染色质,用过量的限制性内切酶酶切消化染色质-蛋白质交联物,在DNA浓度极低而连接酶浓度极高的条件下用连接酶连接消化产物,蛋白酶K消化交联物释放结合的DNA,用推测可能有相互作用的目的片段的引物进行定量PCR来确定是否存在相互作用。
5.如何研究DNA甲基化及其功能
如何研究DNA甲基化及其功能方法概括起来可分为三类:基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找.
1) 基因组整体水平甲基化分析
     a)高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法  b) SssI甲基转移酶法  c)免疫化学法  d)氯乙醛法
2) 特异性位点的DNA甲基化的检测
     a)甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法  b)直接测序法 c)甲基化特异性的PCR
     d)甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)  e)结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)f)甲基化敏感性单链构象分析 g)甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳
h)甲基化敏感性解链曲线分析(methylation-specificmelting curve analysis MS-MCA)
i) 荧光法Methylight) j) DNA微阵列法 k)甲基化敏感性斑点分析(methylation sensitive dot blotassay ,MS-DBA)l) 甲基化特异性多连接依赖性探针扩
3) 甲基化新位点的寻找
   a)限制性标记基因组扫描(restriction landmark genomic scanningRLGS)
   b) MBD(Methyl-CpG binding domain column chromatography甲基化结合区)柱层析法
   c) 联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD功能:DNA甲基化引起基因组相应区域染色质结构变化,使DNA失去核酶ö限制性内切酶切割位点,及DNA酶敏感位点,使染色质高度螺旋化,凝缩成团,失去转录活性5位C甲基化胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶,由此能导致基因置换突变,发生碱基错配: T2G,细胞分裂过程被纠正,会诱发遗传病或癌症,而且,生物体甲基化方式稳定,可遗传的。
6.表观遗传学分为四大类:染色体重塑,DNA甲基化,组蛋白变异体,非编码RNA
 
7.何为质谱,生物质谱的原理分类及各类的特点
质谱是带电原子、分子或分子碎片按质荷比(或质量)的大小顺序排列的图谱。即用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片,有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子-分子相互作用产生的离子)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。
原理:用于分析的样品分子(或原子)在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子,进入由电场和磁场组成的分析器,离子束中速度较慢的离子通过电场后编转大,速度快的偏转小;在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转,即速度慢的离子依然偏转大,速度快的偏转小;当两个场的偏转作用彼此补偿时,它们的轨道便相交于一点。与此同时,在磁场中还能发生质量的分离,这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上,不同质荷比的离子聚焦在不同的点上,其焦面接近于平面,在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线,即质谱。通过质谱分析,我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。
    80年代后, 发明了快原子轰击电离(FAB),电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。生物大分子可转变成气相离子。产生了生物质谱。
   软电离技术  离子化方式柔和,不裂解,可以分析非共价结合的生物大分子复合物,具有高分析速度和灵敏度。
根据生物质谱离子化方式的不同主要是电喷雾电离与基质辅助激光解吸电离,前者常采用四极杆质量分析器,所构成的仪器称为电喷雾(四极杆)质谱仪(ESI-MS),后者常用飞行时间作为质量分析器,所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)。ESI-MS的特点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等现代化的分离手段联用,从而大大扩展了其在生命科学领域的应用范围,包括药物代谢、临床和法医学的应用等;MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高,且测样速度快,操作简单。此外,可用于生物大分子测定的质谱仪还有离子阱(ion trap,IT)质谱和傅里叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance,FTICR)质谱等。
1.电喷雾质谱技术:电喷雾质谱技术(Electrospray Ionizsation MassSpectrometry,ESI-MS)是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子,使质量电荷比(m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用,如液一质联用(LC-MS)是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。
2.基质辅助激光解吸附质谱技术:基质辅助激光解吸附质谱技术(MatriX AssistedLaser Desorption /Ionization,MALDI)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子,因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有—一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测,理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的,因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。
3.快原子轰击质谱技术:快原子轰击质谱技术(Fast Atom Bomebard-ment Mass Spectrometry ,FABMS)是一种软电离技术,是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离子溅出进入分析器,这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析,特加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS只能提供有关离子的精确质量,从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS-MS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息,从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。
4.同位素质谱: 同位素质谱是一种开发和应用比较早的技术,被广泛地应用于各个领域,但它在医学领域的应用只是近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力,该化合物又易于用同位素标示,人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含量以达到检测该病原菌的目的,同时也为同位素质谱在医学领域的应用开辟了一条思路。

8.蛋白质组学的研究内容
 
9.图示操作基因的基本步骤
 
10.什么是工具酶,常用的工具酶,其功能是怎样的
工具酶是在基因工程中起到特定功能的酶的统称。
DNA限制性内切酶:生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息。

11.基因操作的载体必须具备的特征是什么,常用的质粒载体有哪些
载体是指运载外源性DNA(目的基因DNA)有效地进入到受体细胞内的工具。
必须满足:①分子相对较小(3~10kb左右),能进行复制,且具有高拷贝数。
②具有几个单一的酶切位点,以便所要克隆的DNA片段能够连接、插入载体,酶切位点应该在载体的复制子以外适当的位置。
③外源性DNA插入后,载体在受体细胞中的复制不受影响。
④载体本身应对受体细胞无害,以及能接纳尽可能大的外源性DNA片段。
⑤有便于筛选的明显标志,如耐药性、空斑形成等,以便于阳性克隆细胞容易被选出。容易从宿主细胞中分离纯化。
⑥具有促进外源性DNA表达的调控区。
⑦生物防护安全,不污染环境。
常用的质粒载体有:
大肠杆菌质粒(pBR系列质粒、pUC系列质粒载体、pBV220质粒)革兰阳性菌的质粒。

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