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分子生物学实验技术复习资料
华北理工大学医学信息平台 2014-07-15 来源: 原创 点击数:8810
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1. 比较Southern,Northern,Western实验操作步骤的区别
Southern杂交
主要用于分析DNA,也包括正向杂交,反向杂交,斑点杂交
正向Southern杂交是将待测DNA固定在纤维膜上,用特异序列RNA探针与其杂交,再显影观察。
反向Southern杂交是将特异序列RNA固定在纤维膜上,用待测DNA做成探针与其杂交,再显影观察。
Northern杂交
主要用于分析RNA,包括正向杂交,反向杂交,斑点杂交
正向Northern杂交是将待测RNA固定在纤维膜上,用特异序列DNA探针与其杂交,再显影观察。
反向Northern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上,用待测RNA做成探针与其杂交,再显影观察。
Western杂交
主要用于分析蛋白质,利用了抗原抗体特异性结合的原理。分为抗原法,夹心法,竞争法
抗原法是将待测抗原固定在膜上,加特异抗体与其结合,洗膜,显色,观察
夹心法是将一抗固定在膜上,加待测抗原,洗膜,加特异二抗,洗膜,显色,观察
竞争法是分对照和试验两组,对照组将特异抗原固定在膜上,实验组将待测抗原固定在膜上,都加入特异抗体,显色,观察。用于比较抗原的特异性。
Southern 和Northern原理基本相同,都是利用DNA或RNA的复性过程,但过程上也有区别,主要是Southern是先电泳后变性,而Northern是先变性后电泳,RNA是单链分子必须消除局部区域的二级结构,在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小,所以使用变性胶; Southern是碱变性,而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性,因为采用碱变性会导致RNA水解
Southern Blotting和Northern Blotting时使用带有标记(如同位素标记或荧光标记)的DNA或RNA探针去识别并结合到待检测核酸上,然后直接显影;而Western Blotting时要先用待检测蛋白的“一抗”结合到待检测蛋白上,再用可识别“一抗”并偶联了某种酶的“二抗去检测”一抗“,最后通过显色反应的信号来显示待检测蛋白的存在与否及量的多少。
2. 如何利用CHIP技术研究一个新发现的组蛋白修饰的生物学功能
   染色质免疫沉淀技术:是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。基本原理是在活性状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目前片段的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
3. 如何确定一个基因的启动子及其调控原件
 
4.3C技术的基本原理是什么
    染色质构象捕获技术(Chromosome Conformation Capture, 3C)利用PCR定量来分析染色质高级构象,通过测定不同DNA片段之间的连接频率来推测染色质的高级结构。该技术已经被广泛应用在检测染色体内部启动子与其顺势调控元件(例如增强子等)之间所形成的染色质环等高级结构。3C技术路线为:福尔马林瞬时固定细胞核染色质,用过量的限制性内切酶酶切消化染色质-蛋白质交联物,在DNA浓度极低而连接酶浓度极高的条件下用连接酶连接消化产物,蛋白酶K消化交联物释放结合的DNA,用推测可能有相互作用的目的片段的引物进行定量PCR来确定是否存在相互作用。
5.如何研究DNA甲基化及其功能
如何研究DNA甲基化及其功能方法概括起来可分为三类:基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找.
1) 基因组整体水平甲基化分析
     a)高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法  b) SssI甲基转移酶法  c)免疫化学法  d)氯乙醛法
2) 特异性位点的DNA甲基化的检测
     a)甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法  b)直接测序法 c)甲基化特异性的PCR
     d)甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)  e)结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)f)甲基化敏感性单链构象分析 g)甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳
h)甲基化敏感性解链曲线分析(methylation-specificmelting curve analysis MS-MCA)
i) 荧光法Methylight) j) DNA微阵列法 k)甲基化敏感性斑点分析(methylation sensitive dot blotassay ,MS-DBA)l) 甲基化特异性多连接依赖性探针扩
3) 甲基化新位点的寻找
   a)限制性标记基因组扫描(restriction landmark genomic scanningRLGS)
   b) MBD(Methyl-CpG binding domain column chromatography甲基化结合区)柱层析法
   c) 联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD功能:DNA甲基化引起基因组相应区域染色质结构变化,使DNA失去核酶ö限制性内切酶切割位点,及DNA酶敏感位点,使染色质高度螺旋化,凝缩成团,失去转录活性5位C甲基化胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶,由此能导致基因置换突变,发生碱基错配: T2G,细胞分裂过程被纠正,会诱发遗传病或癌症,而且,生物体甲基化方式稳定,可遗传的。
6.表观遗传学分为四大类:染色体重塑,DNA甲基化,组蛋白变异体,非编码RNA
 
7.何为质谱,生物质谱的原理分类及各类的特点
质谱是带电原子、分子或分子碎片按质荷比(或质量)的大小顺序排列的图谱。即用电场和


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