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　　HiC-Pro是一个成熟的Hi-C数据处理软件，负责从原始测序（FASTQ）到互作矩阵（contact maps）的一整套处理：mapping、过滤、fragment分配、生成validPairs、矩阵构建、质量控制等。它还包含多个实用脚本（utilities），用于downstream可视化或特定分析。

　　make_viewpoints.py是HiC-Pro软件中的一个轻量脚本工具，能够从HiC-Pro生成的validPairs（或allValidPairs）与restriction-fragment BED、以及一个viewpoint/target BED，统计每个viewpoint（capture）与基因组上其他fragment的交互计数，并把结果写为bedGraph（方便在IGV/UCSC中查看virtual-4C风格的轨迹）。脚本也会在标准错误中输出每个viewpoint的若干统计量（CAP-REP、CAP-CAP、Excluded等）。

使用前准备

validPairsFile：HiC-Pro产出的有效配对文件（tab分割）。脚本需要该文件每行至少前7个字段：readname, r1_chr, r1_start, r1_strand, r2_chr, r2_start, r2_strand。脚本对格式不符的行会报错并跳过。

fragmentFile（resfrag BED）：restriction fragment的BED（HiC-Pro data_info下通常有），脚本把read的坐标映射到fragment上。脚本需要该文件至少4列：chrom start end name（注意：脚本把BED当作0-based处理）。若行格式不对会报错并退出。

targetFile（viewpoints/capture BED）：每行一个viewpoint，必须含4列chrom start end name（脚本以name作为viewpoint的标识符并用于输出文件名/统计）。可以把 promoter/bait以±bp的区间写在这里。

命令行与常用选项

脚本的选项在源码get_args()和主流程里解析，常用参数如下：

Usage:
  -i/--validPairs   <validPairs file>
  -f/--fragmentFile <restriction fragment BED>
  -t/--targetFile   <target viewpoints BED>
  -c/--cis          Restrict analysis to cis interactions (only chromosomes present in target)
  -e/--exclusion    Size (bp) of upstream/downstream regions around each capture to exclude
  -o/--oprefix      Output file prefix
  -v/--verbose      Verbose mode (prints progress & parameters to stderr)
  -h/--help         Help

各参数注释

-i / --validPairs
指定HiC-Pro生成的validPairs文件路径（文本文件，每行一个有效配对）。
脚本按行读取该文件，解析每一条配对的染色体/位置信息，用来统计viewpoint（capture）与reporter fragment的配对计数。

-f / --fragmentFile
指定限制性内切酶片段（restriction fragments）对应的BED文件路径（resfrag）。
用于把 validPairs 中的 read 坐标映射到对应的restriction fragment（reporter）；脚本把fragment BED加载进染色体索引树以便快速查找。

-t / --target
指定viewpoint / capture（bait）列表的BED文件路径。
脚本把target（capture sites）加载为interval树，用来判定配对的任一端是否落在capture区域（若落在则视为capture端）；对每个被检测到的capture，会累积该capture与各reporter fragment的计数并最终输出bedGraph。

-c / --cis
启用“只统计cis（同染色体）”模式（Restrict the analysis to cis contact）。
当加上-c时，脚本在加载fragment BED时只加载那些染色体与target中出现的染色体（即load_BED(fragmentFile, chroms=target.keys())），能节省内存/时间并确保只统计与目标染色体上的交互。适用于只关心capture同染色体交互的情形。

-e / --exclusion
为每个capture指定向上游和下游排除区的大小（以碱基对bp为单位）。
脚本会为每个target生成两个exclusion interval：[start - exclusion, start) 和 [end, end + exclusion)；如果validPairs的任一端落在这些排除区内，该配对会被记为“Excluded”并计入exclu_counter（不会记为CAP-REP）。这个参数常用来去除近端self-ligation/restriction bias导致的强信号。
注意：传入的值应为整数；排除区不会自动做边界检查（例如start-exclusion可能为负数，通常床文件坐标为0-based，建议检查输入或用合理的exclusion值如500–2000 bp）。

exclusion和target的优先顺序：源码先检查exclusion（若存在），若任一端落在exclusion区则记为excluded；只有在两端都不在exclusion时，才进一步判断是否落在target或fragment。理解这一点有助于选择合适的-e大小。

-o / --oprefix
指定输出文件名前缀（prefix）。
脚本会为每个viewpoint生成一个bedGraph文件；若指定-o PREFIX，文件名形如PREFIX_<viewpoint_name>.bedgraph；否则文件名为<viewpoint_name>.bedgraph。同时脚本会在写文件时在stderr打印Writing in _viewpoint.bedgraph。

-v / --verbose
详细/输出模式（Verbose）。
开启后脚本会打印运行时信息到标准错误（stderr），例如参数值（validPairsFile / fragmentFile / targetFile / cisOnly / exclusionSize / verbose）、数据加载进度提示（每百万行报告一次）以及后续的统计信息等，便于调试与监控长任务。

-h / --help
显示帮助/用法并退出。

示例：该命令会为my_baits.bed中的每个bait生成sample_.bedgraph（如果不使用-o，则输出文件名默认是.bedgraph）。

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标签: Hi-C