CRISPR筛选技术解锁肿瘤免疫治疗新靶点
MHC-I表达缺失或下调是免疫检查点治疗耐药的重要机制，约65%肿瘤患者存在MHC-I相关缺陷。鉴于MHC-I与PD-L1常受共同信号调控，研究者采用双标记CRISPR筛选技术（高低剂量IFNγ诱导）在低表达MHC-I的B16F10黑色素瘤细胞中发现：TNF信号通路关键转导蛋白Traf3特异性负调控MHC-I。通过体内外实验验证，证实增强MHC-I抗原呈递可提升免疫治疗效果，这为MHC-I低表达肿瘤患者的治疗提供了新方向。
肿瘤微环境(TME)中，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是促进进展的重要组分。研究者构建包含4500个肿瘤发生发展及免疫调控基因的小鼠慢性病毒CRISPR敲除文库(MusCK，mouse chronic virus CRISPR-Cas9 knockout)，在表达OVA抗原的4T1细胞中进行多模型筛选。通过两轮筛选发现Cop1缺失可增强肿瘤细胞免疫原性，其机制涉及调控巨噬细胞极化（M2向M1型转化）及稳定C/ebpδ蛋白抑制趋化因子释放，从而提高肿瘤对免疫治疗的敏感性。针对巨噬细胞介导的免疫逃逸，Bassik团队建立全基因组CRISPR筛选平台，在Ramos淋巴瘤细胞中鉴定出APMAP等调控抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)的关键因子，并通过巨噬细胞筛选发现GPR84特异性调控吞噬功能，为开发新型联合疗法提供了理论依据。
表观遗传调控在肿瘤免疫微环境塑造中具有重要作用。研究者在KRASG12D/p53-/-肺癌模型中进行表观遗传靶向sgRNA文库（含524个调控因子）体内筛选，发现组蛋白伴侣Asf1a缺失可增强PD-1疗法敏感性，为表观遗传药物与免疫检查点抑制剂的联用策略提供了实验依据。类似研究采用包含表观遗传和RNA结合因子的sgRNA文库，在联合免疫治疗模型中发现去甲基化酶KDM3A作为免疫抑制因子，其缺失可使肿瘤微环境向T细胞炎性状态转化，显著提升联合疗法疗效。
从上述研究可见，CRISPR筛选技术凭借其高通量特性，能够通过靶向sgRNA文库在肿瘤细胞中开展特定基因功能研究。结合体内外实验验证，该技术可系统解析基因与免疫微环境的动态相互作用，从不同层面揭示免疫治疗的作用机制。这种整合性研究策略不仅为现有治疗方案的优化提供理论支撑，更为新型治疗靶点的发现开辟了多维度的研究路径。
挑战与未来展望
免疫逃逸是肿瘤耐药的关键因素，揭示肿瘤免疫过程中的关键功能基因及其下游调控机制是发展免疫治疗的重要方向。然而免疫应答的异质性和基因调控网络的复杂性，要求我们必须借助更高效精准的工具进行关键基因或节点因子的筛选。CRISPR系统作为新兴的高通量筛选工具，已在肿瘤生物学研究中得到广泛应用。
完整的CRISPR筛选需要依托合适的生物模型、精准的文库基因编辑、特异高效的刺激条件以及精确的数据读出分析，但每个环节都存在局限性。就生物模型而言，若期望实现高通量基因编辑，体外模型似乎更能提供充足的实验对象，但即使采用高保真类器官，其结果的真实性仍难以保证，且难以满足全基因组规模筛选需求，因此在筛选过程中应选择与文库数量级相匹配的筛选模型，通过逐步缩小范围同时提升准确性；在肿瘤免疫方面，免疫细胞数量的限制是筛选的主要难点，但优化后的筛选策略正在突破这一困境，无论是多轮筛选还是正负筛选都展现出独特优势。目前开展的免疫细胞筛选多聚焦于T细胞，这不仅源于其在肿瘤免疫中的重要地位，更得益于T细胞生物模型的成熟发展。未来将CRISPR筛选拓展至其他细胞类型（如树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、B细胞等）仍面临巨大挑战；CRISPR作为包含Cas蛋白、sgRNA及其表达调控元件的多组分系统，选择适宜的递送方式同样存在挑战，尤其在原代细胞和体内筛选中，无论是腺相关病毒（AAV）、脂质纳米颗粒（LNP）、电穿孔还是显微注射等技术，都需实现精准定位与剂量控制。此外，Cas9蛋白作为外源蛋白可能引发的适应性免疫应答可能导致免疫功能紊乱，这也是亟待解决的问题。完成筛选后的数据分析同样不易，高通量编辑引发的基因调控网络重塑影响着免疫应答的异质性，这对CRISPR筛选提出新的挑战；将单细胞测序、空间转录组学等技术与CRISPR筛选相结合，可获取筛选后细胞异质性、功能差异及空间布局等详细信息，进而描绘新的基因调控图谱，这或是突破肿瘤免疫筛选后遗传改变的重要潜在手段。