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铁死亡调控机制以及在肿瘤中的研究进展
来源: 原创 点击数:20038

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  在有效杀死癌细胞的同时又不影响健康细胞的完整性,是当前肿瘤研究的关键挑战之一。癌细胞通常在细胞死亡执行机制中存在缺陷,这是肿瘤治疗中产生抗性的主要原因之一。与正常细胞相比,癌细胞为了生长,会显示出更高的铁需求。这种对铁的依赖性可以让癌细胞更容易遭受铁催化介导的坏死,称为铁死亡。目前,铁死亡有望成为一种杀灭抗药性强的肿瘤的新途径,人们对FDA批准药物中的铁死亡诱导剂抱有很高的期望。

  虽然治疗手段近年来取得了显著进步,但癌症仍然高居全球死亡原因第二位(WHO,2018年)。利用抗癌药诱导细胞凋亡是杀死癌细胞的主要方法之一,然而由于癌细胞对凋亡的获得性或内在的抗性,导致肿瘤凋亡诱导在有效性上受到限制。因此,寻求其他形式的非凋亡性细胞死亡为清除癌细胞以及限制耐药克隆的存活开辟了新的途径。经过二十年的深入细胞死亡领域的研究,Vanden Berghe等人发现了多种调控细胞死亡的新模式。作为清除抗凋亡癌细胞克隆的替代方法,目前正在探索两种类型的细胞死亡模式,即坏死样凋亡(Necroptosis)和铁死亡(Ferroptosis)。人们已发现多种化合物和抗癌药物会引发坏死样凋亡和铁死亡。坏死样凋亡是最典型的调节性坏死形式(regulated necrosis),由与蛋白激酶3(RIPK3)和混合谱系激酶结构域样蛋白相互作用的受体协同作用介导。铁死亡是一种铁催化介导的细胞死亡形式,其通过多不饱和脂肪酸(PUFAs)的过度过氧化而发生(Dixon et al,2012)。由于坏死样凋亡的发生与执行相关的基因在肿瘤中表达下调或沉默,近年来,铁死亡引起了人们的极大兴趣。在这篇综述中,我们首先简要介绍当前铁死亡诱导与执行相关的分子机制的研究进展,以及如何对其进行调节。之后,我们将详细介绍了基于铁死亡的肿瘤治疗策略,最后,我们对该新兴领域提供未来展望。

  铁死亡的执行:脂质中不饱和成分的“生物性锈化”

  Dolma等人利用过表达致癌突变体HRAS的工程细胞进行小分子蛋白的选择性细胞毒性筛选中,铁死亡最初被认为是Erastin和RSL3诱导的细胞死亡的一种独特形式。然而,Dixon等人进一步的研究并不能证实在RAS突变的癌细胞系中Erastin存在选择性杀伤力。从形态上,发生铁死亡的细胞具有典型的细胞死亡形态,如线粒体畸形、膜浓缩和外膜破裂。然而,发生铁死亡的细胞没有显示出任何凋亡的特征,敲除坏死样凋亡介导分子RIPK1和RIPK3也不能保护细胞免于铁死亡。铁死亡存在于哺乳动物细胞膜中,其发生特征是铁催化介导的含PUFA的磷脂(PL)的过度过氧化。将培养体系中补充PUFA会促进细胞铁死亡,而将PUFA重氢化或敲除PLFA参与PL合成所需的基因会抑制铁死亡。在机理上,氧化脂质组学方法可监测到PUFA中亚甲基附近的双键削弱了双烯丙基亚甲基的氢键能,导致去氢反应和随后的氧合敏感性增加。铁死亡发生中的脂质过氧化所导致的有害效应可以被铁螯合剂(如去铁胺(DFO))和各种亲脂性自由基捕获剂(如维生素E,铁蛋白1(Fer1)和脂蛋白1(Lip1))抵消。

  不依赖酶的脂质过氧化

  不依赖酶的脂质过氧化或自氧化过程是由自由基驱动的链反应,其中活性氧(ROS)引发PUFA的氧化(图1)。最具活性的化学活性氧是羟基(OH-),它是一种可移动的水溶性ROS,可引起脂质过氧化。Fenton和类Fenton反应是指过氧化氢(H2O2)与游离不稳定的亚铁离子(Fe2 +)等过渡金属之间的反应,这些是羟基自由基形成的主要来源。作为不依赖酶的脂质过氧化的第一步,羟基自由基从PUFA提取氢形成以碳为中心的脂质自由基(L)。分子氧(O2)与脂质自由基的快速反应会产生脂质过氧自由基(LOO)。随后,脂质过氧自由基可以从相邻的PUFA中提取氢,形成脂质氢过氧化物(LOOH)和新的脂质自由基,这可以引发另一个脂质自由基链反应。脂质氢过氧化物在亚铁的存在下转化为烷氧基(LO),随后与相邻的PUFA反应从而引发另一个脂质自由基链反应。当抑制脂质过氧化的保护分子失效时,这种由铁和氧催化的链式反应可能导致膜破坏和细胞死亡。链断裂亲脂性抗氧化剂作为主要的不依赖酶的防御机制,可通过提供电子来中和脂质自由基;或者在高浓度自由基的条件下,两个自由基可以相互反应并形成稳定的非自由基分子。

  酶促脂质过氧化
酶促脂质过氧化过程受脂氧合酶(LOX)家族的活性影响。LOXs是不含血红素的酶,可催化游离和酯化的PUFA双加氧反应生成各种脂质氢过氧化物(图1)。在哺乳动物细胞中,亚油酸(LA)和花生四烯酸(AA)是最丰富的PUFA,可作为LOX的底物。脂氧合酶5(LOX5)可催化AA在碳5上的氧合反应合成5-氢过氧二十碳四烯酸(5-HPETE)。LOX12和LOX15可催化AA合成12-HPETE和15-HPETE,LA合成9-氢过氧十八碳二烯酸(9-HPODE)和13-HPODE。与LOX5需要先通过胞质磷脂酶A2(cPLA2)从膜PL水解酯化的AA相反,LOX12和LOX15可以直接氧化含AA的PL。在部分类型细胞中,敲除或抑制脂氧合酶可抑制铁死亡过程。最近有人提出,维生素E除捕获亲脂性自由基的活性外,还具有抑制LOX活性的功能,可能对铁死亡具有潜在抑制作用。

  脂质过氧化的毒性
脂质过氧化下游的细胞铁死亡的确切机制尚不完全清楚。该机制可能涉及结构化脂质孔的形成,类似于在坏死样凋亡和焦亡中观察到的蛋白孔。另外,持续不断的广泛氧化和PUFA耗尽可能会改变膜的流动性和结构,并增加膜的渗透性,最终导致膜完整性的丧失。Agmon等人使用分子动力学模型模拟发现,在铁死亡期间,膜变薄和曲率增加会促使氧化分子驱动恶性循环,从而最终破坏膜的稳定性,导致孔和胶束形成。此外,脂质氢过氧化物可能会分解为4-羟基-2-壬烯醛(4-HNEs)或丙二醛(MDA)等有毒醛类分子,它们可以通过交联作用使细胞内蛋白失活进而促进铁死亡(图1)。

  诱导铁死亡的经典途径
经典途径是将膜内抵抗过氧化损伤的保护机制失效进而诱导铁死亡,其中主要的保护机制是通过改变谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)的活性实现的。GPX中的GPX4具有独特的保护能力,可以将插入膜或脂蛋白的PL和胆固醇等复杂脂质中的过氧化氢分解。因此,GPX4被认为是保护生物膜免于过氧化损伤的唯一GPX。而GPX4可以通过直接或间接靶向作用失活(如GPX4的必需辅因子——细胞内谷胱甘肽(GSH)耗竭)(表1)。
  
细胞内谷胱甘肽耗竭
胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白(system Xc-)由二硫键连接的异二聚体SLC7A11(xCT)和SLC3A2(4F2hc)组成,可输入胞外氧化形式的半胱氨酸、胱氨酸来交换胞内谷氨酸。抑制GSH合成所需胱氨酸的导入最终导致细胞内GSH的水平降低。GSH是一种三肽抗氧化剂,可作为硒依赖性GPX4分解脂质氢过氧化物的过程的辅助因子。因此,Earstin耗尽GSH会间接导致GPX4失活(图2A),使脂质ROS积累引发脂质过氧化。值得注意的是,追溯到1950年代和1970年代的早期观察表明,胱氨酸缺乏可抑制细胞培养物的生长,并且这种类型的细胞死亡可被亲脂性抗氧化剂和铁螯合剂抑制。对GSH合成的直接抑制也足以在某些细胞中诱导铁死亡。例如,使用丁硫氨酸磺胺嘧啶(BSO)抑制谷胱甘肽半胱氨酸连接酶(GCL,GSH从头合成的一种酶),在某些细胞环境中可以诱导铁死亡(图2A)。

  GPX4的失活/耗尽
一项蛋白组化学研究表明,铁死亡诱导剂RSL3可与GPX4的活性位点上的硒代半胱氨酸(Sec)共价结合,从而直接抑制GPX4的PL-过氧化物酶活性(图2B)。细胞中GPX4的过表达可增强对RSL3诱导的铁死亡的抗性,而敲低GPX4则促进铁死亡(Yang等,2014)。ML162 、withferin A(WA)和美国食品药物管理局(FDA)批准的抗癌药altretamine等其他化合物也可以通过灭活GPX4(图2B)来诱导铁死亡。FIN56通过结合和激活鲨烯合酶(SQS)(一种参与胆固醇合成的酶)促进铁死亡。此外,脂溶性抗氧化剂辅酶Q10(coQ10)和Sec-tRNA分子的代谢障碍可能会导致GPX4的消耗/失活(图2C)。类似地,GPX4的遗传耗竭导致脂质ROS的快速积累,这些过程可以被亲脂性自由基陷阱和铁螯合剂抑制。

  诱导铁死亡的非经典途径
在脂质过氧化机制方面,铁在铁死亡中发挥重要作用。大部分呈Fe2 +形式的小铁池,称为不稳定铁池(LIP),可以通过Fenton反应直接催化自由基形成,并可以进一步引发脂质过氧化。此外,铁和铁衍生物,如血红素或铁硫[Fe-S]簇,对于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氢化物(NADPH)氧化酶(NOX),LOX和线粒体电子转运复合物等可产生ROS的酶的活性至关重要,这些酶可以促进ROS的产生。诱导铁死亡的非经典途径,是指通过增加LIP引发的铁死亡,例如由于血红素加氧酶1(HMOX1)过度活化,铁转运蛋白表达降低或转铁蛋白表达增加等。在Bax/Bak双敲除细胞中,作为铁载体蛋白的全转铁蛋白在氨基酸缺乏时,也会释放铁,诱发铁死亡(表1)。尽管其作用机理仍不清楚,但使用例如氯化铁、血红蛋白、血红素或硫酸亚铁铵的导致铁超载,也会诱发细胞铁死亡(图2D)。

  促铁调节剂
由于铁死亡是由ROS、铁和PUFA引起的代谢功能障碍的结果,因此调节铁或能量代谢、脂质合成和氧化应激相关的各种基因和信号通路,可影响铁死亡的敏感性(表2和图3)。

  铁代谢

  铁是一种氧化还原活性金属,可参与自由基的形成和脂质过氧化的发生(图3C)。因此,铁水平升高可增加铁死亡的发生率。与铁稳态有关的各种基因或蛋白质,包括铁稳态的输入、输出和储存,已被证明可调节铁死亡的敏感性(表2;图3A和3B)。抑制固氮1(NFS1,一种半胱氨酸脱硫剂,由半胱氨酸提供硫从而合成铁硫蛋白),可同时增加转铁蛋白受体(TFRC)水平和降低铁蛋白(FTH)水平,通过激活铁缺乏反应增强细胞发生铁死亡的敏感性。溶酶体通过FTH的降解(铁蛋白吞噬作用)可以积累大量铁(图3D),抑制溶酶体活性或使核受体共激活因子4(NCOA4)沉默(一种转运受体,可将FTH募集到自噬体中降解并释放铁),抑制铁死亡。HMOX1的过度活化,可催化血红素-铁、胆绿素和一氧化碳的降解,通过增加LIP增强铁死亡。HMOX1的抑制或沉默,可抵抗由withaferin A、erastin和Bay 11-7085诱导的铁死亡。然而,HMOX1由于其抗氧化性,在一定活化程度上也可以发挥细胞保护作用;而其毒性作用则归因于在铁蛋白缓冲能力不足的情况下促进了Fenton介导的过氧化物分解,从而使亚铁生成增多。因此HMOX1的过度上调可能导致细胞毒性,而适度上调可能具有细胞保护作用。

  脂质代谢

  从头合成途径合成的脂肪酸参与磷脂形成,需要在酰基辅酶A合成酶(ACS)催化下将长链脂肪酸转化为酰基辅酶A(CoA),然后在溶血磷脂酰转移酶(LPLATs)催化下进行再酰化。在这过程中,长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)可将AA转化为酰化AA,溶血卵磷脂酰基转移酶3(LPCAT3)可催化酰化AA插入PLs。敲除ACSL4或LPCAT3可增强细胞抵抗铁死亡的能力(表2和图3H)。最近,蛋白激酶级联支架蛋白的抑制剂,磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1),被证明能结合并引导LOX15至多不饱和脂肪酸,之后进入细胞膜,促进铁死亡发生。FIN56可通过甲羟戊酸途径诱导铁死亡发生(图3F)。甲羟戊酸的直接代谢物,异戊烯基焦磷酸盐(IPP)对于胆固醇的生物合成,Sec-tRNA的异戊烯基化以及CoQ10的合成至关重要。抑制胆固醇合成途径中异戊烯基焦磷酸下游的鲨烯合酶(SQS)或鲨烯单加氧酶的活性参与,可抑制铁死亡的发生;反之,他汀类药物抑制异戊烯基焦磷酸合成上游的HMG-CoA还原酶,会促进铁死亡的发生。推测甲羟戊酸可通过以上两种机制影响铁死亡。Sec-tRNA的成熟是将Sec结合至GPX4所必需前提,而抑制异戊烯基焦磷酸合成会干扰Sec-tRNA的成熟。此外,抑制辅酶Q10的产生可导致线粒体呼吸功能异常和氧化损伤。在这方面,补充辅酶Q10可有效抑制铁死亡。

  (抗)氧化剂代谢
谷胱甘肽代谢与抗氧化能力能够调节细胞对铁死亡的敏感性(表2)。将NADP(H)丰度作为生物标记物,使用转录组数据分析了60种不同人类细胞系(NCI-60),结果显示细胞系中对受铁死亡刺激的敏感性与对受铁死亡诱导剂的敏感性呈反相关(Shimada et al。,2016a)。当System Xc-(胱氨酸谷氨酸反向转运体)被抑制时,蛋氨酸通过转硫途径提供半胱氨酸将胱硫醚合成谷胱甘肽,从而调节细胞内铁死亡(图3G)。在沉默某些tRNA合成酶(CARS、HARS和EPRS)之后,转硫途径增强,使细胞降低对Erastin诱导的铁死亡的敏感性,提示抑制tRNA合成酶可以诱导一种整合的应激反应,促进半胱氨酸的合成,从而最终促进GSH的合成。重要的是,抑制或沉默核因子E2相关因子2(NRF2)可增加细胞对铁死亡的敏感性,体现了其在诱导抗氧化机制中的关键作用。Erastin和sorafenib处理细胞后,NRF2蛋白水平升高,可使细胞对铁死亡产生抵抗,这种保护作用归因于NQO1、HMOX1和FTH1等NRF2靶基因的上调。线粒体的电子传输链(ETC)是哺乳动物细胞中形成ROS的重要来源。虽然最初发现缺乏线粒体的细胞仍然对铁死亡敏感,然而以类似但更广泛的方法抑制ETC复合物的活性或耗尽线粒体,可以避免由胱氨酸缺乏或Erastin引起的铁死亡,但其仍对GPX4抑制引起的铁死亡敏感。

  能量代谢
由胱氨酸缺乏引发的铁死亡需要谷氨酸代谢参与,即谷氨酰胺分解。抑制SLC1A5转运蛋白摄取谷氨酰胺、抑制线粒体谷氨酰胺酶(GLS2)将谷氨酰胺代谢为谷氨酸,以及阻止谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1(GOT1)催化谷氨酸合成α-酮戊二酸,这些方式可抵抗铁死亡的发生(表2)图3E)。谷氨酰胺分解过程可通过在线粒体三羧酸循环中提供α-酮戊二酸(aKG)来调节铁死亡。抑制磷酸戊糖途径(PPP)或沉默两种PPP酶(6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)和磷酸甘油酸脱氢酶(PGD))会阻碍人肺癌细胞中erastin诱导的铁死亡。PPP产生NADPH,这对于保持细胞内GSH水平和对铁死亡的抵抗能力至关重要;但是,它也可以提供NADPH转化为NOX,从而在某些细胞环境中有助于ROS的产生,促进铁死亡。

  铁死亡和肿瘤
肿瘤抑制因子(如BAP1和p53)控制着铁死亡的激活(表3)。此外,在各种实验性肿瘤模型中多种小分子和FDA批准的临床药物在肿瘤细胞中诱发了铁死亡,以及在各种实验性肿瘤模型中利用铁死亡诱导剂对肿瘤实现了抑制的功效,这些都强调了铁死亡可作为一种潜在的新型抗肿瘤疗法。此外,铁死亡能够杀伤抗药性强的肿瘤细胞的功效更进一步印证其应用价值。

  BAP1介导的铁死亡调节
肿瘤抑制因子BAP1编码一种核去泛素化酶,其形式为多梳抑制性去泛素酶(PR-DUB)复合物,通过减少核小体中的组蛋白2A泛素化以表观遗传方式调控基因表达。BAP1突变存在于多种散发性人类肿瘤中,其种系突变被认为是遗传性肿瘤的重要诱因。BAP1的抑癌活性部分是由铁死亡介导的,其催化SLC7A11启动子H2A去泛素,导致SLC7A11表达受到抑制。同样在体内,在缺乏BAP1的细胞中恢复BAP1表达可抑制移植瘤的生长。人肿瘤相关的BAP1突变不能抑制SLC7A11的表达,也不能促进铁死亡,这体现了BAP1介导的铁死亡对肿瘤的抑制作用。

  p53介导的铁死亡调节
TP53基因编码的基因组守护者p53是至关重要的肿瘤抑制因子,在超过一半的人类肿瘤中均发生了突变或失活。p53的肿瘤抑制活性主要与它在诱导细胞周期停滞、衰老或凋亡方面的经典功能有关。另外,p53在控制新陈代谢和氧化还原状态方面的非经典功能也可以通过调节铁死亡来发挥肿瘤抑制作用。根据p53突变状态和细胞环境,p53可以响应氧化应激而具有促铁蛋白原或反铁蛋白原功能(表3)。p53可能起变阻器的作用,在基础或低ROS胁迫下预防铁死亡,而在高氧化应激下促进铁死亡。
在细胞应激下,p53通过转录抑制SLC7A11从而抑制胱氨酸的摄取来增强细胞对铁死亡的敏感性。例如,nutlin-3对p53的激活会触发ROS应激,从而触发骨肉瘤U2OS细胞中的铁死亡。调节SLC7A11表达需要p53的DNA结合结构域发生乙酰化。然而,具有三个突变赖氨酸的乙酰化缺陷型突变体p53(K117 / 161 / 162R,称为p533KR)不能诱导细胞凋亡、衰老和细胞周期停滞,但可以增强细胞对铁死亡的敏感性。p533KR转基因小鼠不会形成自发性肿瘤,这表明p53通过诱导铁死亡抑制了肿瘤的形成。与p533KR相比,在四乙酰化缺陷型突变体p534KR无法抑制SLC7A11,并且不能抑制移植瘤形成。p53还可以通过其代谢靶基因亚精胺N1-乙酰基转移酶(SAT1)来调节铁死亡,该基因编码参与多胺代谢途径的蛋白质,而该蛋白质通常在人类肿瘤中被下调。敲除SAT1可以显着消除p53介导的铁死亡效应,而SAT1表达水平的升高会使细胞在ROS压力下增强对铁死亡的敏感性。p53中的S47位点多态性(TP53S47)也可削弱p53抑制SLC7A11转录的能力,使细胞不易发生铁死亡。尽管p53S47可以诱导细胞凋亡、衰老和细胞周期停滞,但p53S47转基因小鼠很容易自发肿瘤。TP53的错义突变所导致的其他p53突变形式,例如p53R273H和p53R175H,可以通过阻碍NRF2介导的SLC7A11上调来抑制SLC7A11表达。有趣的是,使用激活剂APR-246重新激活p53G266R可恢复柳氮磺胺吡啶对system XC-的抑制作用,这会阻碍移植瘤的生长。
显然,在某些细胞环境中,p53还可以负调控铁死亡。通过nutlin-3稳定和恢复野生型p53的活性,可通过p53-21依赖性途径维持细胞内GSH水平抑制system XC-功能来保护纤维肉瘤、肾癌和骨肉瘤细胞免受铁死亡。这可能使肿瘤细胞在代谢应激条件下(如胱氨酸缺乏)具有生存优势。通过p53阻断二肽基-肽酶4(DPP4)的活性提出了另一种机制,该酶可阻断大肠癌细胞中由erastin诱发的铁死亡。在不存在p53的情况下,DPP4与NOX1相互作用,形成一个NOX1-DPP4复合物,该复合物介导质膜脂质过氧化和铁死亡。

  耐药肿瘤细胞对铁死亡的敏感性
引发铁死亡是杀伤耐药肿瘤细胞的最佳方法之一。例如,通常高表达ZEB1的耐药间充质细胞对由GPX4抑制或他汀类药物治疗引起的铁死亡高度敏感。猜测ZEB1可以作为脂肪形成因子并调节脂质代谢,从而在间充质基因表达和脂质过氧化物脆弱性之间建立桥梁。同样,在癌症治疗中面临重大挑战的耐药性持久性细胞的存活也依赖GPX4的存活,这使GPX4成为诱导铁死亡的理想靶标。在黑色素瘤移植瘤模型中,GPX4是肿瘤复发所必需分子。BRAF激酶抑制剂vemurafenib可增强耐药黑色素瘤细胞对由多种触发因素诱导的铁死亡的敏感性。在对耐药高危神经母细胞瘤中,铁死亡似乎也很有效。我们发现,用withaferin A可同时以经典与非经典途径诱发铁死亡,抑制肿瘤生长,并且与依托泊苷或顺铂相比,在神经母细胞瘤移植瘤的发生率方面表现出更强的功效。

   

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